将Cas9-GFP:Atp2b2-mut1:lipo2000注射到P1 Atp2b2Obl/+小鼠的内耳中。注射后4天,取角膜器官GFP阳性感觉上皮。在对含有Obl和WT等位基因的基因组区域进行DNA提取和PCR扩增后,进行扩增子测序分析,以评估编辑效率(图4上),结果显示,注射Cas9-GFP : Atp2b2-mut1:lipo2000溶液的Atp2b2Obl/+小鼠,在Obl位点上发生0.4...
由于该产品中的质粒实现了GFP连接的Cas9表达盒,荧光激活细胞分选(FACS)可用于分离Cas9诱导修饰频率显著增加的细胞群(图2)。这种FACS富集方法在递送效率和/或Cas9表达水平低或检测不到的情况下特别有用。此外,GFP共表达方法比替代性报告载体更有优势,包括: a) Cas9-GFP连接的表达不需要额外的步骤将人工靶位点克隆到...
为了评估基于噬菌体的 CRISPR的递送方法之功效，他们用绿色荧光表达蛋白 (GFP)、目标细菌（基因）位点或红色荧光蛋白mCherry作为对照的大肠杆菌菌株，去定植小鼠，然后对小鼠进行噬菌体治疗，之后再对小鼠粪便样本中荧光细菌进行分析。携带CRISPR的噬菌体将有效负载传递到目标细菌群体，消除了小鼠肠道中大多数含有GFP的大肠...
图 1.CRISPR/Cas-GFP载体的示意图。图 2.在现有的大多数CRISPR应用中，gRNA和Cas9都是表达自两个不同的载体。当转换为单一载体形式后，针对人KRAS基因座的gRNA设计显示出了在人K562细胞中保留对插入缺失高水平的诱导。单质粒GFP的形式可确保所有所需的CRISPR/Cas成分（如Cas9和gRNA编码序列）都能有效地递送至GFP...
为了利用CRISPR/Cas9方法在红色毛癣菌中进行基因敲除,我们使用两种不同的质粒pCas9GFP(表达eGFP标记的Cas9核酸酶,Cas9GFP)和psgRNA5.0(表达基因特异性sgRNAs)来靶向pacC基因(Figure1)。本文设计了四种不同的sgRNA:与pacC外显子1互补的sgRNA-1和sgR...
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理 CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割，造成双链DNA断裂，然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR）...
CRISPR/Cas9技术是一项革命性的基因编辑工具，它为生物学和医学领域带来了前所未有的可能性。其中，基因敲入和点突变是CRISPR/Cas9技术的两个重要应用方向。基因敲入原理基因敲入是指在生物体的基因组中插入外源基因或修饰现有基因。CRISPR/Cas9通过引导RNA的序列特异性与目标基因相结合，再由Cas9蛋白负责切割DNA，从而...
1、dCas9-VP64 VP64是单纯疱疹病毒16(VP16)的四聚体,可在转录水平激活基因表达。Gilbert等人(Gilbert Luke A et al.,2013)将dCas9与VP64融合蛋白,有效地激活了Gal4UAS-GFP的表达。此外,在特异靶向NTF3和VEGFA的单个或多个sgRNA的引导下,dCas9-VP64显著增加了基因的表达,表明该融合蛋白可以特异性地激活内...
图1 体外光诱导CRISPR-Cas9介导的GFP DNA切割 环状crRNA在活细胞中光控CRISPR/Cas9编辑 血管内皮生长因子A是内皮细胞在缺氧和炎症刺激下分泌的一种强效和特异性有丝分裂原。研究人员使用了这种光响应CRISPR-Cas9编辑策略来破坏人类293T细胞中的VEGFA基因。制备对应的NPBOM修饰VEGFA- crRNA -a和环状产物VEGFA- crRNA-...
首先，Cas9是一种关键的核酸内切酶，用于在CRISPR系统中进行基因编辑。它需要特定的向导RNA来指导其在DNA序列上的精确切割。与此同时，puro/gfp作为标记元件，通常用于筛选或标记成功表达Cas9的细胞。在这种情况下，插入序列的作用在于将Cas9和标记元件整合在一起。为了解决这一问题，科学家们引入了多顺反子...