免疫荧光成像实验的结果显示Cas9 delNLS严格位于细胞质中,而不是像Cas9 NLS在细胞质和细胞核中均有分布(下图)。 Cas9-delNLS / gRNA抑制HIV-1基因表达的程度与Cas9-NLS / gRNA类似,此外,rt-PCR结果显示,Cas9-delNLS / gRNA和Cas9-NLS / gRNA都降低了晚期病毒DNA和整合病毒DNA的水平。 此外,Cas9-delNLS / ...
CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA,且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下,生物体内启动HDR修复路径,将一段外源DNA定点插入基因内部。 同源性定向修复(HDR)途径,对比NHEJ修复途径,同源性定向修复(HDR)途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中,...
teton诱导质粒是利用teton诱导系统来条件性启动Cas9的表达，第一可以达到空间、时间特异性敲除的效果；第二采用慢病毒系统进行实验时，Cas9/sgRNA会插入到宿主基因组上形成稳转，Cas9会在细胞内一直表达，这会导致较高的脱靶效应。而teton诱导系统则可在敲除完成后关闭Cas9的表达，从而避免严重的脱靶效应。CRISPR/Cas9的脱...
OneShine™CRISPR/Cas9基因敲除细胞文库 一、原理 Lenti-CRISPR V2质粒图谱如上所示。gRNA与Cas9蛋白结合于同一个载体上。我们设计合成了12万个gRNA(靶向约2万个基因),分别连接到Lenti-CRISPR V2载体上,然后把12万个质粒混合起来,形成CRISPR/Cas9 基因敲除质粒文库。并且我们将此文库整合到了细胞中,一个125cm²...
最终,研究人员利用SITE-Seq来描绘了一组sgRNP生化切割的图谱,检测了靶向人类基因组的sgRNA的Cas9特异性,这些位点的数目取决于sgRNA序列和核酸酶浓度,在较低浓度下鉴定的位点显示出细胞中脱靶突变的倾向性较高,脱靶位点列表也指出细胞内Cas9活性受到sgRNP递送,细胞类型和暴露于核酸酶的持续时间的影响。
1 .设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版 2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒 3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞 4 .嘌呤筛选,检测荧光 5 .PCR检测基因组,RFP蛋白是否敲入 实验步骤: 1 设计sgRNA及修复DNA模版 针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位...
CRISPR/Cas9质粒载体 转座子载体Tn5,Tn7,Tn10,PiggyBac 假单胞菌表达载体敲除质粒 谷氨酸棒状杆菌表达/敲除载体 链霉菌/链球菌表达载体敲除质粒 细胞永生化质粒载体 线虫表达载体敲除质粒 自杀质粒载体Suicide Vectors 昆虫细胞表达载体 酵母单杂交双杂三杂载体yeast hybrid 金黄色葡萄球菌表达/敲除载体S.aureus Vectors...
1,电子图谱的酶切 将下载的pX330序列用Clone Manager打开,点击小剪刀,输入BbsI,点击OK, 2.1,质粒的酶切 拿到引物和pX330质粒后,需要酶切和连...
(仅供参考)某公司内部的CRISPR-Cas9操作流程 Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程 Genloci Classic CRISPR-Cas9内 部操作流程 Protocol No. PT140726-1