2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动...
图2.慢病毒混合筛选工作流程。使用 LentiArray 慢病毒 Cas9 核酸酶选择杀稻瘟素抗性,生成表达 Cas9 的稳定细胞系。然后,以适当的 MOI 值用 LentiPool sgRNA 文库转导这些 Cas9 表达细胞,并进行嘌呤霉素抗性选择。然后对转导的细胞群施加选择性压力或处理,如药物或化学扰动物质。分离基因组 DNA 并通过 PCR 技术扩增...
CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中,最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系,确保每个细胞只进入1个病毒,从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。 阳性或阴性筛选筛选 工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同,CRISPR高通量筛选分为...
CRISPR/Cas9全基因组敲除文库筛选鉴定出MAPK通路中的SHP2是茶叶素诱导细胞凋亡的关键靶点。细胞热位移实验(CETSA)和表面等离子体共振(SPR)实验进一步证实了SHP2与茶叶素直接结合。通过SHP2敲低或药理抑制SHP2/SOS1/MAPK通路明显减弱了茶叶素诱...
以下是CRISPR-Cas9技术的基本操作流程: 1. 设计指导RNA(gRNA):CRISPR-Cas9系统的核心是gRNA,这是一种特异性的RNA分子,能引导Cas9蛋白到目标DNA序列。设计阶段,科学家需要选择一个与目标DNA序列匹配的20个核苷酸序列,并将其连接到Cas9蛋白识别的支架RNA上。 2. 合成gRNA和Cas9蛋白:一旦设计好gRNA,就需要通过体外...
全基因组sgRNA文库可同时对多个细胞的不同基因进行编辑，之后，辅以特定的筛选方案，通过功能性筛选和富集、PCR扩增、NGS测序和生信分析等手段，可确认符合条件的相关基因。由于基因组序列中原间隔序列邻近模块序列（protospacer adjacent motif，PAM）的广泛存在，运用CRISPR/Cas9技术基本能实现对基因组中所有基因的编辑。
在确认好筛选所使用的细胞扰动方式后,需明确筛选范围、筛选要求来选择sgRNA文库。筛选范围可选择全基因组级别的文库或特定基因集合的亚文库,并根据实验需求决定使用现成的商业化文库还是定制专属的gRNA文库。筛选要求定义了实验的目标,包括功能缺失(如使用CRISPR-Cas9产生基因敲除)、功能获得(如利用CRISPRa激活基因表达)、...
图3. ATLL细胞系的全基因组敲除文库筛选确定9个关键基因(PMID: 34818414) 02 线粒体自噬 2022年9月,Jonas Benjamin Michaelis等人在nature communications上发表“Protein import motor complex reacts to mitochondrial misfolding by reducing protein import and activating mitophagy”,该研究发现由前序列易位酶相关运...
1 内源性高通量上调编码基因的慢病毒文库。 2 包含70290个sgRNA靶点慢病毒文库。 3 同时靶向23430个编码基因转录本。 4 文库慢病毒总量约 5*108TU。 ➤个性化定制CRISPR/cas9慢病毒文库 HYY服务优势: HYY拥有CRISPR ko (GeCKO) 慢病毒文库及CRISPRa (SAM) 慢病毒文库,提供从药物发现到一体化服务的整体解决...