2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动...
图2.慢病毒混合筛选工作流程。使用 LentiArray 慢病毒 Cas9 核酸酶选择杀稻瘟素抗性,生成表达 Cas9 的稳定细胞系。然后,以适当的 MOI 值用 LentiPool sgRNA 文库转导这些 Cas9 表达细胞,并进行嘌呤霉素抗性选择。然后对转导的细胞群施加选择性压力或处理,如药物或化学扰动物质。分离基因组 DNA 并...
CRISPR/Cas9文库筛选技术可实现全基因组范围的高通量筛选,其针对每个基因设计3-10条sgRNA,利用芯片一次性合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA探针,通过克隆构建载体库,经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞,使得理论上每个细胞整合一条sgRNA,构建获得覆盖全基因组的基因敲除细胞池;经过筛选后,提取基因组并针对整合的sgRNA...
CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中,最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系,确保每个细胞只进入1个病毒,从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。 阳性或阴性筛选筛选 工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同,CRISPR高通量筛选分为...
图2:全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛流程及茶叶素诱导自噬抑制示意图。 Guan-Nan Li et al., Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022 Sep 12;7(1):317. ★文库来源:购买自Addgene (#1000000049) 和元生物可提供本文所涉及的...
1 内源性高通量上调编码基因的慢病毒文库。 2 包含70290个sgRNA靶点慢病毒文库。 3 同时靶向23430个编码基因转录本。 4 文库慢病毒总量约 5*108TU。 ➤个性化定制CRISPR/cas9慢病毒文库 HYY服务优势: HYY拥有CRISPR ko (GeCKO) 慢病毒文库及CRISPRa (SAM) 慢病毒文库,提供从药物发现到一体化服务的整体解决...
全基因组sgRNA文库可同时对多个细胞的不同基因进行编辑，之后，辅以特定的筛选方案，通过功能性筛选和富集、PCR扩增、NGS测序和生信分析等手段，可确认符合条件的相关基因。由于基因组序列中原间隔序列邻近模块序列（protospacer adjacent motif，PAM）的广泛存在，运用CRISPR/Cas9技术基本能实现对基因组中所有基因的编辑。
先看流程: 如果CAS9和sgRNA通过两个载体导入细胞,那么需要就叫做“双载体”系统,看左图。 如果CAS9和sgRNA通过一个载体导入细胞,那么需要就叫做“单载体”系统,看右图 。 筛选原理: 主要原因是利用了慢病毒整合基因组的特性,以单载体文库说明: 一定用慢病毒?慢病毒除了整合的特性,还有如下特点,让你不得不爱: ...
Cas9蛋白是一种以RNA为导向的DNA内切酶,是一种操纵基因组的强大工具[1]。更多的研究者获益于基于CRISPR的遗传筛查,对已确定的基因有更多基因功能表型的认识[2]。早在2013年,海外的两个研究团队分别在Science杂志同一期上发表了CRISPR文库的相关研究[3,4]。这是首次关于CRISPR文库的研究,显示出比shRNA文库更有效的...
一般筛选需要1~2个星期。 7.在转导sgRNA文库前2~7天改用正常培养基培养。 (或者先测定MOI值后,根据MOI加病毒的量,操作可参照sgRNA的转导) 三、检测病毒转染的结果 1.试剂盒提取质粒 2.PCR扩增()。 引物: Forward Primer: dCas9-F2 CCAAAGAGGTGCTGGACG Reverse Primer: Blast-R GCTCTTTCAATGAGGGTGGA 3.2...