以阵列板形式提供,每孔含一个基因靶点(可多达 4 个 gRNAs)。与高通量筛选平台相容。 LentiPool CRISPR 文库 将不同 gRNA 慢病毒在一个管中混合。无需高通量基础设施即可进行 CRISPR-Cas9 筛选。 CRISPR 文库使用我们的专有 gRNA 设计算法构建,整合了最新的研究成果和我们广泛的内部经验。选择的 gRNA 设计提高了...
3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动后，仅有抗性的细胞存活，这类细胞被编辑的基因可能是细胞存活抑制基因。阴性筛选是选取不同筛选时间点的存活细胞，通过比较细胞内sgRNA丰度差，获得缺失的sgRNA，分析其所对应的基因...
阴性筛选是选取不同筛选时间点的存活细胞,通过比较细胞内sgRNA丰度差,获得缺失的sgRNA,分析其所对应的基因,这些基因可能是细胞存活必须基因。 4. 高通量测序与生信分析:从筛选的细胞亚群中提取基因组DNA,然后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增,随后对这些区域进行高通量测序,统计sgRNA相对丰度。根据筛选前后的sgRNA丰度变化确...
使用脂质体转染试剂将重组质粒转染到细胞中。 4.筛选和验证基因敲除: 使用抗生素筛选转染成功的细胞。 提取基因组DNA,使用PCR和测序验证基因X的敲除。 5.功能分析: 比较敲除基因X的细胞和对照细胞(未经编辑的细胞)的增殖能力,使用MTT或CCK-8实验评估细胞增殖。 分析敲除基因X对细胞周期和凋亡的影响,使用流式细胞术...
重组工程的一个缺点是,编辑成功之后,需要通过位点特异性重组系统 (比如Flp/FRT) 来除去筛选标记 (抗性基因),这个过程费时费力;而且,筛选标记去除之后,还会留下一段FRT序列,无法做到无缝编辑。但是,相比CRISPR/Cas9介导的方法,重组工程也有优点,那就是不需要构建sgRNA质粒。有一种方法能结合两者的优点,做到不需要构建...
Srinivas等人在Oncogene杂志上发表“PLK1 inhibition selectively induces apoptosis in ARID1A deficient cells through uncoupling of oxygen consumption from ATP production”,该研究通过高通量化学筛选发现肿瘤抑制因子ARID1A缺失的细胞对PLK1抑制非常敏感。相反,Brunello慢病毒sgRNA表达文库筛选表明,ARID1A缺陷细胞对PLK1抑制...
图2. CRISPR/Cas9全基因组功能筛选系统工作流程(图片来源:参考文献【1】) ①确定表型与基因筛选范围;②构建全基因组敲除或激活基因的sgRNA文库;③包装慢病毒文库,通过低感染复数(multiplicity of infection, MOI)的全基因组慢病毒文库并感染目的细胞,构建稳定表达sgRNA的细胞文库并获得稳定表达株;④筛选细胞表型:对转染...
图1：Tc毒素全基因组筛选 接着研究者进一步揭示了双翅目的埃及伊蚊，疟蚊以及鞘翅目的赤拟谷盗Visgun同源蛋白均可高效识别pTc毒素，而来源于鳞翅目的草地贪夜蛾和大腊螟Visgun同源蛋白则不能作为受体. 通过比对它们的蛋白序列，提示具有高度富集O-glycan修饰位点是不同昆虫物种Visgun同源蛋白能否作为pTc毒素受体的...
通过CRISPR/Cas9进行基因组范围内的基因敲除筛选，可以发现与某种生物过程或疾病相关的关键基因。这种技术在药物靶点发现和功能基因组学研究中尤为重要。6. 农业应用：CRISPR/Cas9可以用于改良作物和家畜的基因，提升作物产量、抗病性和环境适应性。例如，利用CRISPR技术增强作物的抗旱性或提高作物营养价值。7. 基因治疗：...