四、WB检测，适用于获取不同的敲除单克隆细胞株后的检测，鉴定目标基因功能是否被完全敲除最彻底的方法。提取部分单克隆细胞株蛋白，利用特异性抗体进行WB检测目的蛋白是否表达，通过结果分析敲除效果。若抗体特异性好（条带单一）还可以简化为Dot blot，同时快速检测多个单克隆细胞株的敲除情况。图4. Dot blot结果示意...
即非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR），而基因敲除则利用的是NHEJ的修复方式，在Cas9切割诱导DNA双链的断裂后，细胞启动NHEJ修复机制，在修复过程中通常会发生碱基插入或
对于非编码RNA敲除或特定基因组片段的删除,操作流程和以上相同,不同的是要在敲除片段的两端各设计一条gRNA,通过实验筛选两条有编辑效果的gRNA,两条gRNA和Cas9一起或分开同时转入细胞中,才能达到片段敲除的目的(图9),但是通常需要在片段两端前后100~300bp左右的位置来设计gRNA,所以这种方法只能达到非精准的片段敲除。...
提取部分单克隆细胞株蛋白,利用特异性抗体进行WB检测目的蛋白是否表达,通过结果分析敲除效果。若抗体特异性好(条带单一)还可以简化为Dot blot,同时快速检测多个单克隆细胞株的敲除情况。 图4. Dot blot结果示意图 汉恒专营工具病毒十余载,可提供CRISPR/Cas9相关质粒、病毒工具以及敲除细胞株构建服务,如有技术问题或产...
基因敲除实验一般要经过以下几个过程:确定敲除目标基因及细胞→根据目标基因设计sgRNA序列→构建sgRNA及Cas9表达载体(质粒、病毒等)→转染细胞→筛选阳性混合克隆→挑选并培养单克隆→检测编辑效率,鉴定敲除类型→成功建立KO细胞系。本期内容,小编整理了几种CRISPR/Cas9系统编辑效率验证的常用方法,供小伙伴们参考。
基因敲除实验一般要经过以下几个过程:确定敲除目标基因及细胞→根据目标基因设计sgRNA序列→构建sgRNA及Cas9表达载体(质粒、病毒等)→转染细胞→筛选阳性混合克隆→挑选并培养单克隆→检测编辑效率,鉴定敲除类型→成功建立KO细胞系。本期内容,小编整理了几种CRISPR/Cas9系统编辑效率验证的常用方法,供小伙伴们参考。
基因敲除实验一般要经过以下几个过程:确定敲除目标基因及细胞→根据目标基因设计sgRNA序列→构建sgRNA及Cas9表达载体(质粒、病毒等)→转染细胞→筛选阳性混合克隆→挑选并培养单克隆→检测编辑效率,鉴定敲除类型→成功建立KO细胞系。本期内容,小编整理了几种CRISPR/Cas9系统编辑效率验证的常用方法,供小伙伴们参考。
5. 筛选混合克隆,检测敲除效率 细胞转染表达载体48h后,可通过抗性或荧光标记筛选获得成功转入Cas9和gRNA的混合克隆细胞株,以提高获得单克隆的概率,随后抽提部分混合克隆的基因组通过PCR测序鉴定是否有套峰(图5),根据套峰的杂乱程度可以估算编辑效率,也可用T7E1错配酶酶切定量编辑效率(图6)。
赛尔瑞成采用CRISPR/Cas9系统,提供基因敲除细胞系构建服务。赛尔瑞成根据目的基因序列设计合成sgRNA,将Cas9和sgRNA基因转染目的细胞,进而敲除目的基因,并进行单克隆筛选,获得基因敲除单克隆细胞系。 CRISPR/Cas9系统作为新一代基因编辑工具,因其构建方便、设计灵活,操作简单、效率高成本低,成为基因敲除的新一代利器。该系统...
利用慢病毒感染实验细胞，细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因进行切割，最终导致基因完全敲除或在目标位点产生突变，达到基因敲除的目的。5.筛选敲除阳性混合克隆，检测敲除效率。通过抗性或者荧光筛选获得多克隆阳性细胞池，由于细胞的NHEJ机制具有随机性，不同的阳性细胞可能会形成不一...