多基因敲除载体构建CRISPR/Cas9系统是近年来快速发展的一种简单高效的基因编辑系统.在哺乳动物中,同时靶向敲除多基因的研究仍然较为匮乏.为优化哺乳动物中靶向多基因的敲除系统的构建,本研究在已有的CRISPR/Cas9载体的基础上进行升级改造,将4个U6启动子介导的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达框串联至一个载体中...
在CRISPR-Cas9系统中,Cas9被引导到特定的DNA序列,然后对目标DNA进行切割。 在基因敲入敲除策略中,科学家首先需要设计一个靶向基因的CRISPR-Cas9系统。这个系统包括一个向导RNA和一个Cas9蛋白,向导RNA能够与目标基因精确配对。然后,科学家将这个系统插入到一个载体中,并将载体转化到目标细胞系中。载体可以是质粒或病毒,...
4.验证敲除效果:通过Western blot、RT-PCR等方法检测KDM2A基因的表达水平,验证敲除效果。 四、S100A9基因敲除小鼠的构建 1.设计并合成sgRNA和Cas9蛋白:针对S100A9基因序列设计sgRNA,并利用胚胎显微注射技术将复合物注射至小鼠受精卵中。 2.胚胎移植与繁殖:将注射后的受精卵移植至假孕母鼠体内,待小鼠出生后进行基因型...
径。其中,CRISPR-Cas9 系统是一种广泛使用的基因编辑工具,其具 有高精度和高效率的特点。本实验旨在构建基于CRISPR-Cas9 的拟南 芥CCT7 基因编辑载体,并通过实验验证其有效性。 二、材料与方法 1、材料 实验材料选用野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana),种子由实验 ...
1. KDM2A基因敲除细胞系的构建与验证 (1)成功构建了针对KDM2A基因的CRISPR/Cas9表达载体,并转染至细胞系中。 (2)通过PCR和Western blot等方法,验证了KDM2A基因的成功敲除。 (3)KDM2A基因敲除细胞系在体外培养过程中表现出特定的生物学特性改变。 2. S100A9基因敲除小鼠的构建与验证 (1)将CRISPR/Cas9表达载体注...
(3)构建基因截短体质粒; (4)亚克隆质粒构建; (5)通过慢病毒介导的基因过表达; (6)通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减 (7)通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除 注意事项: 本产品仅供科研使用,严禁用于人体或其他非科研用途。 使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品,避免直接接触皮肤和眼睛。
(3)添加 polyA 序列、回收可得到用于显微注射的 Cas9 mRNA(添加 polyA 序列可增强 mRNA 的稳定性和翻译效率)。 2.制备 gRNA (1)制备 gRNA 的 PCR 体外转录模板:用 T7-er fwd 和 tracr rev 引物对,(mRNA 大小约为 2 000 bp)以构建好的 gRNA 体外转录载体为模板,使用高保真酶 PCR,得到 gRNA 体外转录...
CRISPR/Cas9 技术原理在动物基因敲除中的应用 靶向识别：在动物基因敲除中，CRISPR/Cas9 系统的向导 RNA（gRNA）起着关键的靶向引导作用。gRNA 包含一段与目标基因互补的序列（约 20 个核苷酸），它能够精准地将 Cas9 蛋白引导至动物基因组中目标基因的特定位置。例如，在小鼠基因敲除实验中，通过设计针对特定基因的 ...
CRISPR/Cas9 系统是一种高效的基因编辑工具,在动物基因敲除中得到广泛应用。首先,确定要敲除的目标基因,针对该基因设计特定的向导 RNA(sgRNA)。sgRNA 能够引导 Cas9 蛋白准确识别并结合到目标基因的特定序列上。
图2:T7E1检测基因组水平功能验证。将针对靶基因设计的5条sgRNA构建到sgRNA病毒载体,通过顺转导入CAS9稳转工具细胞株,可到>70%转染效率。转染3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率,可见sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有较高切割效率。 图3:成功构建基因敲除单克隆细胞株。将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板,扩增后的...