一般应用Cre-loxP系统进行基因操作时较为常见的形式是两种转基因动物进行杂交。具体流程如下: (1) 利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特异性启动子,利用启动子控制Cre重组酶的表达; (2) 在胚胎干细胞(ES)中通过置换型载体进行同源重组,向基因组靶位点引入选择标记基因,并在其两侧引入两个...
新霉素抗性基因(neo)和单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)为正负选择(positive and negative selection)系统,是筛选和富集同源重组细胞广泛应用的方法 ;该方法虽然使基因打靶技术可适用于任何外源目的基因,但也有一个严重的缺陷,即发生同源重组的细胞基因组中总留有选择标记(neo)基因,该基因可能影响相邻基因的表达...
大咖来袭!上海南模生物副总经理孙瑞林博士,具备多年 Cre 工具鼠研发和使用经验,就“ Cre-loxP 系统介绍及使用问题”这一主题进行的一场免费网络直播讲座回放。, 视频播放量 57842、弹幕量 254、点赞数 1416、投硬币枚数 923、收藏人数 4269、转发人数 1403, 视频作者 南
特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR基因,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,去除基因组上的kanR基因,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。下图是研究人员利用Cre/loxP敲除系统敲除谷氨酸棒状杆菌argR基因(精氨酸代谢的调控因子...
根据Cre重组系统诱导基因重组的方式，我们可以通过如下三种策略实现Cre依赖的基因表达：1、LSL序列（条件性基因选择）将LoxP2和转录终止信号盒（Transcription STOP cassette）插入启动子和目的基因之间，转录终止信号盒两端各有一个同向的LoxP位点，组成LoxP-STOP-LoxP-gene模式，即LSL序列。
一、Cre/Loxp系统 Cre重组酶（37℃）➢位点特异性重组酶，介导loxp位点间的序列同源重组 ➢70%重组率，无需辅助因子，多种结构的DNA底物 Loxpsite ➢34bp反向重复序列 Flp/Frt重组系统 P1噬菌体 （1）重组方式 （2）基因敲除机理 Offspring：50%heterozygousknockoutafter1generation 基因敲除机理（续）Offspring...
当然,因为动物细胞内发生染色体同源重组的频率并不高,所以后续还需要对es细胞进行筛选,筛选后将敲除成功的es细胞注入假孕小鼠囊胚,得到嵌合体小鼠后代,继续传代可以得到纯合子小鼠(一般>=2代)。 基于这一项技术,我们可以构建携带loxp序列的目的基因载体,替换靶基因序列,得到携带loxp序列的小鼠。之后再用同样的方法构建...
一般应用Cre-loxP系统进行基因操作时较为常见的形式是两种转基因动物进行杂交。方法为: (1)利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特异性启动子,利用启动子控制Cre重组酶的表达; (2)在胚胎干细胞(ES)中通过置换型载体进行同源重组,向基因组靶位点引入选择标记基因,并在其两侧引入两个同向排列...
位点特异性重组的生物酶。它的发现为基因靶位操 作创造了有利条件,通过位点特异性DNA重组,实 现靶基因结构部分或全部破坏,使其产物不能正确 表达,从而对基因功能的研究产生重大影响。cre/ loxP系统由cre重组酶及识别序列loxp位点组成。 通过在靶序列引入标记基因和两侧的loxp位点,以 cre酶介导位点特异性重组。cre酶...
Cre(FLP)重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入倒要删除的基因片段两侧。建立条件性基因敲除需要分三步进行:1、通过同源重组的方法在待测删除片断的两侧引入同向的loxP位点(此步同ES细胞的打靶,只是载体不同),用Cre的瞬时表达载体转染ES细胞克隆,在Cre...