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PMSF(100mM) 磷酸化蛋白酶抑制剂 BCA蛋白定量检测试剂盒 5*/2*蛋白上样缓冲液 SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 蛋白Marker PVDF膜 0.45μm 脱脂奶粉 TWEEN 20 ECL 显影定影试剂 转移缓冲液 电泳缓冲液 TBS缓冲液 3、 COIP实验步骤 (1)细胞蛋白提取 1.1 细胞培养(贴壁细胞:100mm细胞培养皿中单层细胞长满80%-90%或者...
使用如NP-40或Triton X-100此类含温和的非离子型去垢剂的非变性裂解缓冲液,并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化,并对样本严格要求新鲜制备,对非特异性蛋白做预处理防治非特异性吸附,重重细节苛求确保最终呈现清晰背景。 浓度精准 实验经验总结出不同状态下实验中抗体浓度,精准掌握最佳值,并在必要时...
1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling.Nature Plants.2019,IF=13.256. 【研究内容】:客户发现,作为内体蛋白分选转运复合体成分之一的FREE1基因,受到脱落酸刺激时候会发生磷酸化并移位到细胞核。客户利用酵母双杂交技术找到两个核蛋白A...
利用肿瘤基因组图谱(Cancer Genome Atlas, TCGA)数据分析ATF1和MMP2在胃癌中的表达及其预后作用。采用免疫共沉淀法(co-IP)结合质谱分析(MS),以鉴定可能磷酸化ATF1蛋白Thr184位点的上游激酶。 ● 研究结果 在126例胃癌患者中发现高水平的p-ATF1-T184与淋巴结转移和低生存率显著相关。P-ATF1-T184促进胃癌细胞的...
简单的说IP就是用抗体把你要的蛋白免疫沉淀下来，然后去检测它。例如蛋白A在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这是可以用A蛋白的抗体+prorein A beads来IP，从细胞中把A拉下,再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）来检测A的变化。而co-ip的原理是一样的，自是它检测的是和A...
翻译后修饰的功能鉴定:磷酸化,乙酰化糖基化以及泛素化的激活定位和功能。 蛋白质互作的研究:清晰阐明蛋白复合体各同伴间的组合的功能意义。 细胞器定位的研究:确定蛋白质的空间功能位置。 注:上述现象与机制发掘的线索和论证基本可以通过CoIP+WB+GO达成。
加1ml(800uL)冰冷的IP细胞裂解液到细胞培养皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂(1:50)和PMSF(1:100),如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂(1:100),注意抑制剂要现加现用】4℃裂解细胞10min,再用移液器反复吹打贴壁细胞,然后将细胞悬浮液转移到15ml离心管中; ...
1. 细胞裂解要采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质与蛋白质的相互作用,多采用非离子去垢剂(NP40 或Triton X-100),不能用高浓度的去垢剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,通常Leupeptin和Aprotinin这两种即可,若蛋白较大,可加胰蛋白酶抑制剂(PMSF),若涉及到磷酸化信号转导,要加磷酸化抑...
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体,直接检测western,就可以了,为什么还要用IP以后的样品来检测,这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好,可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉,所以我们一般为了准确性,看其磷酸化的变化,就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来,在用4G10抗体来检测。而且这个方法看的是Pyk2...