常见的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、糖基化、乙酰化、甲基化等等。在疾病研究中，如何阐明某个蛋白的翻译后修饰过程是十分重要的，也有助于文章分值提升。然后，用什么样手段能够简单而有效的去验证蛋白翻译后修饰是困扰很多研究者的问题，而Co-IP技术就可以轻松解决这一问题。图1 蛋白翻译后修饰的常见方式（L...
避免使用强烈的变性剂如SDS;裂解液中应加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化;应避免在洗涤步骤中通过超声处理、涡旋裂解细胞,以防止破坏靶复合物的蛋白质-蛋白质相互作用;另外,可通过共价交联结合伴侣的方式加强蛋白-蛋白互作
结构干扰 提前查阅文献了解蛋白“爱好”,重视蛋白修饰,如磷酸化、乙酰化等是否会影响复合物的稳定性。 表达水平 提前验证目标蛋白表达水平,表达低可考虑优化转染或表达条件。 温度 低温环境下制备样品,防止蛋白“跑路”。 抗体选择:定向输出 抗体选不好,后果你懂的…… 无论是拉下目标蛋白还是背景干扰,抗体都能“一...
控制实验:进行正负对照实验,确保实验结果可靠。 样品处理:尽量减少样品处理过程中的蛋白降解和磷酸化变化。 洗涤:去除非特异性结合的蛋白,但避免过度洗涤。 数据解读:精心分析实验结果,考虑非特异性结合或其他实验误差因素。0 0 发表评论 发表 作者最近动态 热情洋溢的红椒 2025-01-10 新西兰小学体验:阅读课上的惊喜...
磷酸亲和层析法:适用于富集磷酸化的蛋白质或磷酸化的肽段。 GST pull-down法:适用于对GST标签蛋白或蛋白质片段进行富集。 选择富集方式时,应该考虑如下因素: 样品来源和样品纯度:选择不同的富集方式需要不同纯度的样品。如果样品中目标蛋白质浓度较低,则需要选择比较敏感的富集方式。
由于细胞裂解物含有蛋白酶和磷酸酶,会导致靶蛋白的修饰和降解,所以在样本制备过程中需要加入蛋白酶抑制剂;如果是研究磷酸化,还要加入磷酸酶抑制剂,以确保最后的结果可靠且可重复。此外,IP/Co-IP实验多在4°C下进行操作,以抑制剂酶活性。 现在,商品化抑制剂混合物由于其更易用,更高效和更安全的特点,已成为普遍选...
PKN2通过直接结合和激活DUSP6降低Erk1/2的磷酸化 背景简介 蛋白激酶N2(PKN2)是PKC相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作者实验中发现PKN2通过抑制Erk1/2磷酸化抑制IL4和IL10的表达。双特异性磷酸酶6 (DUSP6)是一种细胞质MAP激酶磷酸酶,可作为Erk1/2的抑制剂。然后免疫组化结果发现PKN2与DUSP6在人结肠癌组织中的...
应使用非变性裂解缓冲液,其中应包含温和的非离子型去垢剂(如NP-40或Triton X-100),避免使用强烈的变性剂如SDS;裂解液中应加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化;应避免在洗涤步骤中通过超声处理、涡旋裂解细胞,以防止破坏靶复合物的蛋白质-蛋白质相互作用;另外,可通过共价交联结合伴侣的方式加强蛋白-...
大部分近端蛋白在体内或体外表现出BIN2依赖性磷酸化,表明这些蛋白是BIN2的底物。作者通过蛋白分析建立了BIN2信号网络,揭示了BIN2在调节关键细胞过程中的功能。进一步研究发现,GSK3的磷酸化组与O-GlcNAc糖基化组之间存在显著的重叠,这表明GSK3与营养感应的O-糖基化途径之间可能存在着一种古老的进化联系。总的来说...
1.磷酸化位点分析 2.激酶活性分析 3.乙酰化位点发现与鉴定 免疫共沉淀的应用场景 (2)免疫共沉淀(Co-IP)一般可用于以下的研究分析 1.利用质谱鉴定相互作用蛋白 2.蛋白相互作用的验证 3.缺失分析联合co-IP进行蛋白互作结构域分析 4.测定两种目标蛋白质是否在体内结合 ...