1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。 3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。 4.加入0.9 ml的蛋白A-Sepharose悬液,4℃摇动...
1) 蛋白降解,加入蛋白酶抑制剂。 2) 所用beads量不够,加大免疫复合物使用的beads量。 3) 样品中目标蛋白量不够,提高样品量。 4. 多条非特异条带: 有非特异性的蛋白结合在beads上,可以尝试提高modified RIPA Buffer中NaCl浓度 5. beads聚集:未按步骤预洗beads。
1. 在离心管中,将每个样品的细胞裂解液与 2-10 μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为 500-1000 μg,由 Pierce BCA Protein Assay蛋白浓度检测试剂盒测定。 2. 用免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液将抗体/裂解液稀释至 500 μL。 3. 在室温下孵育 1-2 h,或 4℃过夜,以形成免疫复合物。 三、...
这个步骤的目的是为去除样本中可与protein A/G琼脂糖珠非特异结合的蛋白质，减少干扰，非必做，如CoIP实验中发现有较多杂带，可考虑做一下；但应注意，选择此步骤后，需要消耗琼脂糖珠，后续能够进行免疫沉淀的次数也相应减少。※ 阴性对照IgG组出现条带是什么原因？首先需要排除lgG和后续WB一抗同源导致的轻重链...
coip免疫共沉淀实验步骤coip免疫共沉淀实验步骤 嘿,咱今儿就来唠唠这coip免疫共沉淀实验步骤哈! 首先呢,得把咱要用的细胞或者组织啥的准备好呀,这就好比做饭得先有食材不是。然后呢,用合适的裂解液把这些细胞或者组织给裂解咯,让里面的蛋白质啥的都释放出来,这就像是把食材给切好准备下锅。 接下来,把裂解液和...
这个步骤的目的是破坏细胞膜,并释放细胞内的蛋白质。 第二步:抗体的选择和固定 在本实验中,我们的目标是研究泛素修饰的蛋白质。因此,我们需要选择一种针对泛素的抗体以进行免疫共沉淀实验。先进行预先固定泛素抗体,可选择将其与蛋白A/G磁珠/琼脂糖绑定,然后用磷酸盐缓冲液将其洗净。 第三步:抗体的交联和洗脱 将...
接着进行免疫共沉淀步骤。留取部分上清液作为input组，提前准备琼脂糖凝珠并加入A蛋白抗体和细胞裂解液。在4°C下摇床孵化，期间可准备下一步的Western blotting。结束后离心并洗去上清，确保沉淀的悬浮，并重复洗沉淀三次。最后进行Western blotting检测，点样顺序通常按照Co-IP组、Input1、Marker、IP组、...
免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。 实验步骤详解: 一、细胞总裂解液的制备 ① 转染后24h收集细胞,1400r X 3min,4°C离心,弃去上层培养基 ② 冰上静置裂解细胞,加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA...
1、 实验简介 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 2、 实验流程 3、 样品要求 1) 动物组织样品：>100mg (黄豆粒大小)2) 细胞样品:>4*107 3) 植物组织>5g 4、 注意事项 客...