方案三:标签类(Flag,HA,GFP,myc等)IP通过过表达方式,将目标IP蛋白带上Flag,HA,GFP,myc等标签,可极大方便后续的实验检测。 ①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠,IP实验会比较容易操作,由于标签抗体非常成熟,IP抗体与WB抗体选择不同种属来源,即可避免轻重链问题。 ②WB选择直接HRP标记的标签抗体(如Flag
通过免疫沉淀的过程,将复合物捕获到亲和树脂上。 2.3洗脱和分离:通过一系列洗涤步骤,去除非特异性结合的蛋白质,使得只有与目标蛋白质相互作用的蛋白质保留在亲和树脂上。然后,用适当的缓冲液洗脱目标蛋白质及其相互作用的蛋白质。 2.4质谱分析:将洗脱的蛋白质样品进行质谱分析,通常采用质谱仪进行蛋白质的鉴定和定量。常...
最后通过液相色谱串联质谱技术可以对酶解后的肽段进行质谱分析，从而分析与目的蛋白相互作用的未知蛋白。IP-MS不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。2、实验步骤 IP-MS的实验流程如下图所示，包括：（1）材料获取：细胞或组织。（2）蛋白提取：可根据目的蛋白...
AIP后WB检测到目的蛋白条带，说明IP过程成功。我们从自身技术流程步骤做排查，确保相关质控均合格，通过标准品检测质谱当时的状态正常，保证技术流程及质谱性能均无问题。如果确实质谱未发现目的蛋白，通常是由于蛋白本身在样品中相对丰度较低导致，由于质谱过程中其他相对高丰度的蛋白可能掩盖部分信号、导致样品中低丰度蛋白...
在CO-IP-MS实验的最后一步，需要对洗脱出的蛋白质进行质谱分析。以下是质谱分析的步骤：2.质谱仪分析：将消化后的肽段通过质谱仪进行分析。质谱仪可以根据肽段的质量和荷电量来确定其序列和标识。通过CO-IP-MS实验，科学家们可以研究蛋白质间的相互作用关系，揭示细胞内复杂的信号传导网络。这项技术在生物药物研发...
图1:标准 Co-IP 协议中的步骤。 1. 裂解你的细胞 在这里,您轻轻地打开您的细胞,使您的蛋白质接触到抗体。 裂解方法在 Co-IP 中很重要。 非去污剂、低盐裂解缓冲液是可溶性蛋白质 Co-IP 的流行选择。 这种裂解最不可能干扰任何蛋白质相互作用。
2 操作步骤与结果分析Co-IP 实验流程图 2. Co-IP 实验流程图[1][5]。Co-IP 流程 (以内源性 Co-IP 为例)[1]1样本准备采用适当的方法收集细胞，使用含有合适的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。2固相介质准备将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出，用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。3...
因此，以后在研究一个未知蛋白的互作蛋白时可以首先考虑IP-MS哦！另外，大家如果想了解更多关于IP-MS的内容，可以查阅小远的往期文章：筛选目的蛋白的互作蛋白方法之IP-MS、你还在小瞧质谱吗？>>>案例三 2019年4月15日，He等人在Plant Physiology上发表了题为：Mitochondrial Pyruvate Carriers Prevent Cadmium Toxicity...