方案三:标签类(Flag,HA,GFP,myc等)IP通过过表达方式,将目标IP蛋白带上Flag,HA,GFP,myc等标签,可极大方便后续的实验检测。 ①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠,IP实验会比较容易操作,由于标签抗体非常成熟,IP抗体与WB抗体选择不同种属来源,即可避免轻重链问题。 ②WB选择直接HRP标记的标签抗体(如Flag-HRP mab)...
共沉淀质谱(Co-immunoprecipitation Mass Spectrometry, Co-IP-MS)是一种结合了共沉淀(Co-IP)和质谱(MS)技术的强大工具,用于鉴定特定蛋白质复合体中的成分以及研究蛋白质之间的相互作用。这项技术特别适用于探索蛋白质功能、信号传导途径和疾病机制。 一、实验流程 ...
1.洗涤：使用洗涤缓冲液多次洗涤免疫共沉淀复合物，去除非特异性结合的蛋白质。2.洗脱：使用洗脱缓冲液将目标蛋白质从免疫共沉淀复合物中洗脱出来。洗脱缓冲液的选择取决于实验需求。步骤四：质谱分析 在CO-IP-MS实验的最后一步，需要对洗脱出的蛋白质进行质谱分析。以下是质谱分析的步骤：2.质谱仪分析：将消化后的...
最后通过液相色谱串联质谱技术可以对酶解后的肽段进行质谱分析，从而分析与目的蛋白相互作用的未知蛋白。IP-MS不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。2、实验步骤 IP-MS的实验流程如下图所示，包括：（1）材料获取：细胞或组织。（2）蛋白提取：可根据目的蛋白...
4. 相互作用分析 经过IP与CO-IP实验后，获得的纯化蛋白质可以用于进一步的相互作用分析。以下是常用的相互作用分析方法：4.1 免疫印迹（Western blot）通过免疫印迹技术，可以检测目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。将纯化的蛋白质进行电泳分离，然后使用特异性抗体进行检测。4.2 质谱分析（Mass spectrometry）质谱分析...
4.质谱分析 最后，将分离的蛋白质样品进行质谱分析。质谱分析可以通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）来实现。通过与数据库中的蛋白质序列比对，可以鉴定出沉淀物中的蛋白质成分。三、co-ip ms的应用 co-ip ms技术在生物药物领域有着广泛的应用。它可以帮助我们揭示蛋白质互作网络，从而深入理解细胞的生理过程...
三、Co-IP结合质谱分析的步骤 样本准备:细胞裂解,提取蛋白质。 Co-IP实验:使用特异性抗体捕获目标蛋白质及其相互作用蛋白。 洗涤和洗脱:去除非特异性结合的蛋白质,收集共沉淀的蛋白质。 质谱样品准备:蛋白质消化成肽段,准备进行质谱分析。 质谱分析:通过LC-MS/MS等技术对肽段进行分析,鉴定蛋白质。
图1:标准 Co-IP 协议中的步骤。 1. 裂解你的细胞 在这里,您轻轻地打开您的细胞,使您的蛋白质接触到抗体。 裂解方法在 Co-IP 中很重要。 非去污剂、低盐裂解缓冲液是可溶性蛋白质 Co-IP 的流行选择。 这种裂解最不可能干扰任何蛋白质相互作用。
1.Co-IP实验与质谱分析的原理与步骤 1.1原理:Co-IP实验与质谱分析相结合的方法可以帮助鉴定和分析蛋白质间的相互作用关系,并解析相互作用蛋白的分子量。其基本原理是通过Co-IP实验富集蛋白质复合物,然后利用质谱分析技术对富集的蛋白质进行鉴定和定量。
CO-IP是一种利用抗体与目标蛋白特异性结合的原理来检测蛋白纯度的方法。其基本步骤包括：将抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物，然后利用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将免疫复合物与其他非特异性结合的蛋白质分离，最后通过洗涤和离心等步骤获得目标蛋白。2.应用 CO-IP广泛应用于蛋白质相互作用研究、信号通路分析和蛋白质...