方案三:标签类(Flag,HA,GFP,myc等)IP通过过表达方式,将目标IP蛋白带上Flag,HA,GFP,myc等标签,可极大方便后续的实验检测。 ①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠,IP实验会比较容易操作,由于标签抗体非常成熟,IP抗体与WB抗体选择不同种属来源,即可避免轻重链问题。 ②WB选择直接HRP标记的标签抗体(如Flag-HRP mab)...
2 操作步骤与结果分析Co-IP 实验流程图 2. Co-IP 实验流程图[1][5]。Co-IP 流程 (以内源性 Co-IP 为例)[1]1样本准备采用适当的方法收集细胞，使用含有合适的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。2固相介质准备将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出，用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。3...
共沉淀质谱(Co-immunoprecipitation Mass Spectrometry, Co-IP-MS)是一种结合了共沉淀(Co-IP)和质谱(MS)技术的强大工具,用于鉴定特定蛋白质复合体中的成分以及研究蛋白质之间的相互作用。这项技术特别适用于探索蛋白质功能、信号传导途径和疾病机制。 一、实验流程 ...
最后通过液相色谱串联质谱技术可以对酶解后的肽段进行质谱分析，从而分析与目的蛋白相互作用的未知蛋白。IP-MS不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。2、实验步骤 IP-MS的实验流程如下图所示，包括：（1）材料获取：细胞或组织。（2）蛋白提取：可根据目的蛋白...
三、Co-IP结合质谱分析的步骤 样本准备:细胞裂解,提取蛋白质。 Co-IP实验:使用特异性抗体捕获目标蛋白质及其相互作用蛋白。 洗涤和洗脱:去除非特异性结合的蛋白质,收集共沉淀的蛋白质。 质谱样品准备:蛋白质消化成肽段,准备进行质谱分析。 质谱分析:通过LC-MS/MS等技术对肽段进行分析,鉴定蛋白质。
4. 相互作用分析 经过IP与CO-IP实验后，获得的纯化蛋白质可以用于进一步的相互作用分析。以下是常用的相互作用分析方法：4.1 免疫印迹（Western blot）通过免疫印迹技术，可以检测目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。将纯化的蛋白质进行电泳分离，然后使用特异性抗体进行检测。4.2 质谱分析（Mass spectrometry）质谱分析...
4.质谱分析 最后，将分离的蛋白质样品进行质谱分析。质谱分析可以通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）来实现。通过与数据库中的蛋白质序列比对，可以鉴定出沉淀物中的蛋白质成分。三、co-ip ms的应用 co-ip ms技术在生物药物领域有着广泛的应用。它可以帮助我们揭示蛋白质互作网络，从而深入理解细胞的生理过程...
因此，以后在研究一个未知蛋白的互作蛋白时可以首先考虑IP-MS哦！另外，大家如果想了解更多关于IP-MS的内容，可以查阅小远的往期文章：筛选目的蛋白的互作蛋白方法之IP-MS、你还在小瞧质谱吗？>>>案例三 2019年4月15日，He等人在Plant Physiology上发表了题为：Mitochondrial Pyruvate Carriers Prevent Cadmium Toxicity...
(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析,通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。