2️⃣ 加入预冷的RIPA Buffer,1ml/107个细胞(10cm培养皿或150cm2培养瓶),0.5ml/5×106个细胞(6cm培养皿或75cm2培养瓶)。 3️⃣ 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min,EP管插冰上,置水平摇床上。 4️⃣ 4℃,14000g离心15min,立即将上...
对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞,并维持较好的生长状态; 如果该实验用于新蛋白的鉴定,应注意抗体重链和轻链的影响; 该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。0 8 发表评论 发表 作者最近动态 玲玲free噜啦啦lu 2024-11-29 天津KET/PET培训推荐:避坑指南天...全文 玲玲free噜啦啦lu...
Co-IP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态,尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提取蛋白的组织等情况时。并且Co-IP的实验条件往往需要反复摸索,因此用于Co-IP实验需准备细胞>2x107,动物组织>500mg,植物组织>2g,样品采集后应速冻于-80℃保存并避免反复冻融。 17、Co-IP实验成功的评...
① 细胞样品准备:3000rpm离心5min收集细胞,PBS漂洗,加入适量modified RIPA Buffer(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min,然后于4℃,12000rpm离心20min取上清; ② 组织样品准备:取适量组织,PBS漂洗,加5倍体积预冷的modified RIPA Buffer于冰上充分匀浆,约5min,然后于4℃,12000rpm离心20min取上清; 2) 取少量上清以备...
答:Co-IP使用Input阳性对照即可,Input即实验使用的细胞裂解液。 3、互作验证一定要western吗?纯化的蛋白可见呢? 答:可见蛋白只能判断蛋白大小,还是需要WB确定就是目的蛋白。 4、Co-IP时,Input的带型不够亮,怎么解决? 答:可以瞬转过表达处理。 5、两个蛋白,哪个适合ip有要求吗?
外源性CO-IP需要转染外源质粒 细胞裂解(常用RIPA并添加PMSF等酶抑制剂) 免疫沉淀反应 磁珠预处理(使用protein A/G或HA等标签磁珠) 目标抗体与磁珠结合(一般抗体使用浓度为10-50ug/mL) 抗原沉淀反应(含有抗体的磁珠与细胞裂解液结合) 抗原洗脱(变性和非变性两种) WB检测及结果分析 ...
②加入400 µl细胞裂解液,吹匀,冰上放置20min; ③12000g,4℃,离心10min; ④弃沉淀,吸上清至一新EP管中,保存于-80℃备用。 2.Co-Immunoprecipitation ①细胞裂解液留取部分做Input用,剩余样品用作免疫共沉淀用; ②预冷PBS洗A/G珠子200ul,分为IP组(160ul)和IgG组(80ul); ...
是同时加进去，还是先转进去一个稳定之后再转另一个？3. 需要细胞量是多少？谢谢！！！
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一般来讲细胞系要比组织更好操作些,如果没有合适的细胞系,直接用动物组织也是不错的选择。此外,如果两个蛋白间相互作用较弱,很容易在样本制备过程中就破坏掉,这种情况下会推荐使用交联剂先固定住蛋白间的相互作用,以保证在后续 Co-IP 实验中被...