步骤 一、细胞的铺板与转染 1、提前一晚将 293T 细胞铺板至 6 cm 皿中,铺板量以达到相应的转染试剂要求为准; 2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染 2 皿细胞:flag 空载+HA-B;flag-A+HA-B;每质粒 2 微克。 二、免疫沉淀 1、转染 24 小...
Co-IP是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法，细胞膜蛋白Co-IP可用于验证细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。在膜蛋白Co-IP实验过程中，首先需要根据细胞膜提取原理从细胞裂解液中提取细胞膜，细胞膜提取的原理为：将细胞暴露于阳离子硅胶珠（直径20-50nm），带正电荷的硅胶...
结论 免疫共沉淀结果表明在正常人甲状腺上皮细胞系中,CXCR3与Beclin1存在相互作用。 案例解读2 ①分子量大小 ②不同的细胞系名称 ③内参蛋白:验证实验条件、排除非特异性结合,并作为实验重复性和准确性的内部对照 ④WCL:全细胞裂解液 ⑤实验组免疫共沉淀的蛋白样品 ⑥IB:是WB所用到的抗体 ⑦对照组 ⑧使用两种不...
Co-IP技术是当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。以细胞内源性靶蛋白(Protein X)为诱饵,将特异性识别Protein X的抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体结合的Protein A/G(预先结合固化在琼脂糖凝胶或磁珠上),这样与Protein X...
Co-IP是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法,细胞膜蛋白Co-IP可用于验证细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。 在膜蛋白Co-IP实验过程中,首先需要根据细胞膜提取原理从细胞裂解液中提取细胞膜,细胞膜提取的原理为:将细胞暴露于阳离子硅胶珠(直径20-50nm),带正电荷的硅胶珠包...
Co-IP实验通常有两种,一种为内源性蛋白相互作用验证,另外一种为非内源性蛋白相互作用验证,内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生,即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达,表达完成后收集细胞进行裂解得到蛋白样...
Co-IP是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法，由于是在非变性条件下研究的，因此可以反映蛋白质在细胞内互作的真实状态。适用于研究两个已知蛋白之间的相互作用关系，也可以提供已知蛋白去寻找与之相互作用的未知蛋白。实验原理 在非变性条件下裂解细胞，以保留活细胞中许多蛋白-蛋白相互作用的复合物。若要研究细胞...
如果想探索细胞内蛋白质相互作用的奥秘,免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation ,Co-IP)是必备的关键工具。通过特定抗体的作用,我们可以捕捉并研究蛋白质之间的相互作用,揭示细胞信号通路中的重要细节。 本文将聚焦Co-IP实验标准操作、结果图解读、21个常见问题分析&解决、实际应用场景等,帮助大家更好的掌握免疫共沉淀技术。
1. 用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次在组织培养盘或瓶內贴壁的细胞，之后排掉PBS。并且也用PBS洗涤非贴壁细胞，接着在桌面型离心机中，用转速800 - 1000转/分钟去离心5分钟，以沉淀细胞。2. 添加冰冷的RIPA改良缓冲液至细胞（加1毫升至每10 7个细胞/100 mm组织培养盘/150平方厘米组织培养盘瓶，加0.5毫升至每5 ×...
① 图1中的Input组是对细胞裂解液的蛋白样本进行WB检测,采用标签蛋白Flag和Myc的抗体去验证蛋白样本中是否存在目的蛋白。图1 A和B的Input结果均表示存在两种目的蛋白。 ② IP组是用含Flag抗体的磁珠进行免疫沉淀,将得到的沉淀复合物进行WB检测,判断protein A和protein B是否存在相互作用。图1A的IP组结果显示,在第...