5、 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃1 h以去除非特异性杂蛋白,降低背景。 6、4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中标号Input,留Protein A珠子,标号IP。 7、变性以及还原蛋白 室温溶解蛋白上样缓冲液(5×),按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合,IP组...
取与IP实验等量的裂解液,使用Isotype Control孵育;与IP抗体孵育同时进行。 Isotype Control选择: 预纯化的目的: 减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。 同时减少了可能与Protein A/G发生交叉反应的蛋白含量。 根据IP实验结果,可以调整每次IP的总蛋白用量。 预纯化流程: 1 取200 μL 1 mg/mL的细胞裂解物与30μ...
Co-IP 优势可沉淀诱饵蛋白在天然组织细胞状态下存在互作关系的所有蛋白；可沉淀整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；可与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证；分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体，结果更真实可靠。Co-IP 分类根据抗体来源、靶蛋白表达方式及样本类型...
蛋白质伴侣:确定一种特定蛋白质的新的作用搭档; 蛋白质复合物分离:分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 02 Co-IP怎么看?(具体案例) 案例解读1 ①IP:说明用什么抗体拉的,这里是利用CXCR3作为诱饵蛋白,用它的抗体下拉蛋白 ②用CXCR3抗体与其本身结合,出现条带,说明抗原抗体结合没有问题 ③CXCR3和Beclin1相互...
● 选用的抗体不合适,建议 IP 验证过的抗体,并优化下抗体用量 ● 蛋白间为弱相互作用,或者相互作用依赖翻译后修饰 5. 琼脂糖难离心,每次总会吸上来一点儿 建议方案: ● 使用带滤膜的离心柱,下部有接样管,琼脂糖完全截留在滤膜上 ● 换成磁珠 如有更多问题,可点击下方图片回看免疫(共)沉淀线上讲座,内容丰富...
IP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%⽢油；pH 7.4 改良型杜⽒PBS （20×），25mL，使⽤时稀释⾄：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7 100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液 洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺 ⾮还原型泳道...
Co-IP实验步骤 一、制备细胞样品 1.10cm盘细胞用PBS清洗两次,加入1mL RIPA裂解液和10μLPMSF(100mM稀释至1mM); 2.充分混匀吹打后,冰上裂解4h,充分吹打吸入1.5mL EP管中, -80℃保存; 3.取出样品,1200rpm离心10min,取上清弃沉淀,测定蛋白浓度。 二、Co-IP,拉出蛋白 1.每管取出少量蛋白样(15~30μL)...
Co-IP是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法，细胞膜蛋白Co-IP可用于验证细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。在膜蛋白Co-IP实验过程中，首先需要根据细胞膜提取原理从细胞裂解液中提取细胞膜，细胞膜提取的原理为：将细胞暴露于阳离子硅胶珠（直径20-50nm），带正电荷的硅胶...