首先是input 对照,Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率。 然后是阳性对照需要使用阳性抗体,一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因(为了保证阳性对照有效,一般选...
与WT对照相比，OdisA菌株中约99% peaks表现出在DasR靶标启动子处ChIP-seq peaks高度增强，证实OdisA菌株...
空白对照的用途:可以判断由ChIP-Seq得到的peak时候具有统计上的显著性。 三种类型的空白对照:1.部分进行免疫共沉淀前的DNA(input DNA),这是最常用的;2.由免疫共沉淀得到而不含有抗体的DNA(mock IP DNA),使用这个的一个问题是收集到的量可能不够;3.使用非特异免疫共沉淀方法得到的DNA. 测序深度:在发表的ChIP-...
ChIP实验,ChIP实验的对照可以说是挺麻烦的一件事情。 首先是input 对照,Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率。 然后是阳性对照需要使用阳性抗体,一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,...
最后阴性对照需要用阴性抗体,用普通的IgG做为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,但是由于非特异结合,或者实验过程中没发生结合的DNA清除不完全,可能也会出现比较浅的条带。 注意, 上述所谓的阴性阳性对照都是针对具体的一次ChIP PCR实验而言的,只能说明这个实验做的有没有物理上的问题。
在评估读取质量和我们应用的任何读取过滤之后,我们将希望将我们的读取与基因组对齐,以便识别任何基因组位置显示比对读取高于背景的富集。 由于ChIPseq 读数将与我们的参考基因组连续比对,我们可以使用我们在之前中看到的基因组比对器。生成的 BAM 文件将包含用于进一步分析的对齐序列读取。
而在最后的分析里,由于峰值会有背景噪音以及文库会夹杂一些没有用抗体捕获的DNA片段也被测序了,所以要通过前期实验尽可能提高峰质量,也就是我们在前面提到的空白对照(control),用来排除假阳性: Input DNA:不用任何抗体捕获的DNA(破碎产物直接解交联,纯化的DNA); ...
mock IP对照:【步骤一样但没有用抗体】 IgG mock IP对照:【步骤一样但换了抗体】 图7:ChIP-seq实验设计 (3)CHIP-seq的主要限制 时间约3天 由于低效的IP步骤,需要数以百万计的细胞起始 在低丰度细胞类型上执行具有挑战性 染色质的交联可能引起抗原表位掩蔽,也会导致非特异性信号 ...
关于阴性对照：由于非特异性结合，IgG原则上不能结合任何蛋白；若IgG作为阴性对照，其带下来的DNA-蛋白质...
mock IP对照:【步骤一样但没有用抗体】 IgG mock IP对照:【步骤一样但换了抗体】 图7:ChIP-seq实验设计 (3)CHIP-seq的主要限制 时间约3天 由于低效的IP步骤,需要数以百万计的细胞起始 在低丰度细胞类型上执行具有挑战性 染色质的交联可能...