选择在三组数据中都有 peak 的区域,Zoom In。在有 peak 富集的区域选择 DNA 序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点,可以先定位到基因,再根据 ChIP-Seq 的数据选择有 peak 富集的区域。 获取DNA 序列 获得DNA 序列了,就可以进一步利用 Primer 5 ...
在这个引物设计页面,你只要改三个地方,如下: 也就是对DNA进行比对,找到这一段序列最合适的引物。接着等待即可: 引物就出来了: 我们可以看到该引物可以扩增出一个87bp的DNA和一个3779bp的DNA,后面这个不影响。因为 我们做ChIP的时候DNA片段都是很小的。长片段已经基本...
最常见是基因的启动子区域或者转录起始位点TSS上下游的2kb左右的区域(可能会包含外显子区域),所以这时候使用在线qPCR引物设计软件或是仪器自带引物设计软件的时候,一定要清晰的明确这一点,要把这个模板区域的序列信息“告知”仪器或是软件,这样设计出来的引物才能符合ChIP-qPCR。
引物设计完成之后,还需要对引物的特异性进行验证,例如oligo7、Primer-Blast、PCR产物琼脂糖凝胶电泳等,防止非特异性扩增对数据分析的干扰(做完qPCR后也可通过溶解曲线是否单一来判断)。 qPCR数据分析 在完成IP实验以及引物设计合成后,就可以进行qPCR实验啦。对每个样本(单个样本通常需要做3个技术重复)的Input、IP、IgG-...
为了确保得到可以信任的ChIP结果,进行适当的QC非常重要。最好的方法是免疫共沉淀反应后进行qPCR检测。使用目标蛋白已知的结合区域和非结合区域设计引物作为阳性和阴性对照进行检测。 详细检测方法可参考文末《往期精彩内容》文章“如何判断ChIP实验是否成功?”及“手把手教您设计ChIP-qPCR引物”。
4、对Input、IP进行建库和测序可进行ChIP-seq分析,设计引物进行qPCR则为ChIP-qPCR实验。 二、引物设计 2-△△CT法计算原理会假设目标基因在不同的富集产物中的PCR效率基本相似,且ChIP在富集时会对DNA进行打断,因此在引物设计时,产物的长度不宜太长,通常150bp附近最佳。 对于富集类实验,老师可以根据前期seq的结果预...
我们最终得到的DNA序列信息,读者也可以选择自己感兴趣的基因或者区域,查看对应的DNA序列信息。得到DNA序列信息之后我们就可以按照常规的引物设计流程设计ChIP实验的引物。 我们推荐大家设计ChIP引物长度18-22nt,扩增产物长度在100-200bp,GC含量在40-60%,Tm值在55-65°C。
一般做chip-qpcr的话,可以先用JASPAR去预测一下结合位点,然后根据位点去设计;或者有seq的结果的话就...
17 附录 附录一:ChIP-qPCR引物的设计 无论是通过ChIP-qPCR来检测ChIP实验是否成功,为后续的建库和测序做准备,还是要 通过qPCR的方式来检测蛋白与目标区域DNA的结合,正确的设计ChIP-qPCR引物会节省大量 的时间和精力. 通常ChIP-qPCR的引物可以从已发表的高分文献中得到,但往往在研究新的靶标时,并没 有参考文献,...