芯片PCR的结果通常以荧光信号的强度来表示,但这种相对表达水平并不能直接用于定量分析。为了得到准确的表达水平,需要使用chip-qpcr计算公式进行修正。该公式的基本原理是通过内部参照基因和标准曲线来校正荧光信号的强度,从而得到准确的相对表达水平。 选择一个稳定表达且与目标基因无关的内部参照基因作为参照。这个内部参照...
图1 普通PCR 结果示意图 但是CST推荐使用实时PCR(qPCR)来分析CIP 结果,因为它是定量的。因此,此文主要讲的是ChIP-qPCR 的设置、计算与评价。 关于PCR 循环数 对于普通的PCR的单拷贝基因,我们建议使用大约30个PCR扩增循环; 对于多拷贝基因,如α卫星重复序列,我们建议使用大约20个PCR扩增循环,以确保PCR反应在线性扩...
2-△△CT法计算原理会假设目标基因在不同的富集产物中的PCR效率基本相似,且ChIP在富集时会对DNA进行打断,因此在引物设计时,产物的长度不宜太长,通常150bp附近最佳。 对于富集类实验,老师可以根据前期seq的结果预测的motif对应的peak两端序列进行引物设计(1),或者利用可视化的软件(如IGV)对peak最明确的位置对应的序列...
加上不同核小体间的linkerDNA序列,这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右,如果片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含目标序列的DNA,但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有700个核苷酸的距离;如果过度片段化可能破坏抗原表位降低PCR效率,片段化不全导致样本丢失,可能会获得假阴性结果。
5. 测定DNA浓度时,将2 µl纯化后的DNA加入到98 µl TE缓冲液中(即稀释50倍),然后读取并记录DNA浓度。并乘以50来计算原管中的DNA浓度,理想的DNA浓度应当在50~200 μg/ml之间。 注意:要得到理想的ChIP结果,合适长度和浓度的染色质样品至关重要。过度消化可能会减弱PCR定量信号。而消化不足可能会导致过高的...
(1)去除duplication。由于PCR过度扩增,会导致同一个模板DNA在文库中出现多次,因此可能被多次测到,这种片段称为duplication。这些片段的存在不仅不会增加有用信息量,反而会导致后续统计产生偏差,因此需要去除。 (2)去除多重比对reads。多重比对reads指比对至基因组多于一个位置的reads,这些reads的存在可能影响统计结果的...
18 如图,这个ChIP-Seq的数据的各个质控参数优良,PBC>82%,表明建库过程中没有PCR bias.用Phastcon检测ChIP-Seq数据中结合位点的保守性,因为TF的DNA结合序列在物种间相 对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠,但 组蛋白修饰并不一定遵循这一规律. 19 第二步,可以同时选几个...
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实验结果的分析则依赖于琼脂糖凝胶电泳，对于Input DNA组而言，预期的片段长度集中于150bp至350bp之间。在内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA进行PCR扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果应为空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带弱或无、内对照组出现强条带、阳性抗体对照组则显示强条...