芯片PCR的结果通常以荧光信号的强度来表示,但这种相对表达水平并不能直接用于定量分析。为了得到准确的表达水平,需要使用chip-qpcr计算公式进行修正。该公式的基本原理是通过内部参照基因和标准曲线来校正荧光信号的强度,从而得到准确的相对表达水平。 选择一个稳定表达且与目标基因无关的内部参照基因作为参照。这个内部参照...
2-△△CT法计算原理会假设目标基因在不同的富集产物中的PCR效率基本相似,且ChIP在富集时会对DNA进行打断,因此在引物设计时,产物的长度不宜太长,通常150bp附近最佳。 对于富集类实验,老师可以根据前期seq的结果预测的motif对应的peak两端序列进行引物设计(1),或者利用可视化的软件(如IGV)对peak最明确的位置对应的序列...
另外在加入反应体系前,将2%样品输入对照做一系列稀释(不稀释,1:5,1:25,1:125),据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。 2. 在每个反应管或孔(板上)中加入2 μl相应DNA模板。 3. 按下面配比配置PCR反应液总管,记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后,向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。
(1)去除duplication。由于PCR过度扩增,会导致同一个模板DNA在文库中出现多次,因此可能被多次测到,这种片段称为duplication。这些片段的存在不仅不会增加有用信息量,反而会导致后续统计产生偏差,因此需要去除。 (2)去除多重比对reads。多重比对reads指比对至基因组多于一个位置的reads,这些reads的存在可能影响统计结果的...
②在交联之前计算平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;③适当延长染色质消化时间。 疑难杂症3:样品输入对照组 PCR 反应中无产物拯救方法:①向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。②优化实验引物的 PCR 条件或设计小于 150 碱基对的引物扩增。③为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色...
18 如图,这个ChIP-Seq的数据的各个质控参数优良,PBC>82%,表明建库过程中没有PCR bias.用Phastcon检测ChIP-Seq数据中结合位点的保守性,因为TF的DNA结合序列在物种间相 对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠,但 组蛋白修饰并不一定遵循这一规律. 19 第二步,可以同时选几个...
将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。最后，去交联并对纯化后DNA进行PCR扩增，高通量测序，最后与已有...
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实验结果的分析则依赖于琼脂糖凝胶电泳，对于Input DNA组而言，预期的片段长度集中于150bp至350bp之间。在内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA进行PCR扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果应为空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带弱或无、内对照组出现强条带、阳性抗体对照组则显示强条...