1、dCas9-KRAB 编码基因中的KruppelAssociation Boxes(KRAB)结构域具有转录抑制作用,人类基因组中大约有350个编码蛋白的基因含有该结构域。Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-...
RNA测序分析表明,这种抑制非常特异,HBE1是最显著被下调的基因。 更令人兴奋的是,S. uberis和S. gallolyticus的dCas9-p300融合蛋白能够有效激活HBG1基因,表明这些新型Cas9在基因激活方面也表现出色。研究团队还证明了S. uberis dCas9-KRAB可以显著抑制治疗相关靶点PCSK9的表达,这对降低胆固醇水平的治疗策略具有重要意义。
实验材料:Cas9-KRAB表达载体、sgRNA表达载体、cible细胞等。实验步骤: 1. 设计靶向性sgRNA,定位于靶基因的启动子上游区域; 2. 构建Cas9-KRAB融合蛋白表达载体,实现其在cible细胞中的稳定表达;3. 构建sgRNA的表达载体,转染至cible细胞; 4. 将Cas9-KRAB表达载体与sgRNA表达载体共转染至cible细胞;5. 提取RNA,通过qRT...
1、dCas9-KRAB 编码基因中的KruppelAssociation Boxes(KRAB)结构域具有转录抑制作用,人类基因组中大约有350个编码蛋白的基因含有该结构域。Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-...
1、dCas9-KRAB 编码基因中的KruppelAssociation Boxes(KRAB)结构域具有转录抑制作用,人类基因组中大约有350个编码蛋白的基因含有该结构域。Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-...
CRISPRi技术利用无核酸酶活性的Cas9蛋白（dCas9）结合基因转录起始位点（TSS），阻碍RNA聚合酶的通过，实现基因沉默。为提高抑制效率，dCas9常融合基因抑制结构域，如KRAB结构域，形成dCas9-KRAB复合物。此外，融合双抑制结构域（KRAB-MeCP2）进一步增强抑制效果。dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统主要包含...
图6 dCas9-KRAB转录抑制系统(Gilbert et al., 2014)。 2 表观基因组编辑 表观基因组是基因组调控的第二级,涉及核小体中组蛋白的DNA甲基化和共价翻译后修饰。组蛋白修饰会改变核小体的净电荷,从而影响DNA和组蛋白之间以及组蛋白本身在核小体间和核内水平上的相互作用。表观遗传调节往往是通过影响一段染色质...
图6 dCas9-KRAB转录抑制系统(Gilbert et al., 2014)。 2 表观基因组编辑 表观基因组是基因组调控的第二级,涉及核小体中组蛋白的DNA甲基化和共价翻译后修饰。组蛋白修饰会改变核小体的净电荷,从而影响DNA和组蛋白之间以及组蛋白本身在核小体间和核内水平上的相互作用。表观遗传调节往往是通过影响一段染色质...
为了进一步提高转录抑制的效率，dCas9可融合某些基因抑制结构域，如KRAB结构域（转录抑制子的保守结构域，可与 DNA 结合蛋白融合以实现靶向转录抑制）。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域（bipartite repressor domain）KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。一个完整的 CRISPRi系统包含两个部分，sgRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者...
b dCas9可能与KRAB或其他转录抑制效应蛋白融合,并与基因转录起始位点结合从而沉默基因转录。c dCas9与p300或其他组蛋白乙酰化酶融合形成的复合体与基因转录起始位点或增强子区域结合,促进组蛋白乙酰化,进而增强基因转录。d. dCas9与DNMT3和其他DNA甲基转移酶融合后...