293T-Cas9说明书
一、试剂 1.细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。 2.转染辅助试剂Polybrene(用水配制为6mg/ml,-20℃冻存)。 3.Cas9表达慢病毒。 4.嘌呤霉素或者G418。 二、实验步骤 1、转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。 2、取出
293T-Cas9细胞是用HEK293T细胞构建的稳定表达Cas9蛋白的细胞株,表达CRISPR/Cas9基因敲除系统中的Cas9蛋白。在转入gRNA表达质粒或者化学合成的gRNA后可以对细胞基因组DNA进行定点切割。也可以配合验证载体pTYNE载体实现对基因敲除靶点的筛选和验证。 文档格式:
Cas9蛋白稳定表达细胞系293T-Cas9对照实验实验原理 pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子,由于不能有效地启动EGFP表达,pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体上错码的EGFP的上游区域设计并构建了Cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照gRNA表达载体pGR-Hygro-P。
图3. 在293T细胞中,22个sgRNA靶点修复结果展示 DNA双链断链的主要修复同路包括NHEJ,MMEJ,SSA和HDR;由于SSA(单链退火)会导致大片段的缺失,HR是一种无错的修复方式,所以目前观察到的修复结果主要是NHEJ或者MMEJ导致。为了研究这两种修复方式对于修复结果的影响,作者对比了添加NU7441对于修复产物比例的影响。NU7441是一...
(5)回收后的DNA样本,经T7 Endonuclease I 酶解验证错配DNA,部分结果如下: T7 EI 验证成功,开始正式实验 时间飞逝,上次说提取质粒后验证,这部分就花了一天时间;加上打台风影响细胞复苏,耽误了1-2天,复苏细胞后隔一天立刻传代种板,第二天发现细胞稍微少了一点,又等了一天,转染后虽然是72h应该收sample,但细胞...
3、细胞培养:使用适宜的培养基培养目标细胞,通常选择293T细胞,以确保细胞处于最佳的生长状态。 4、转染试剂准备:在进行转染前,将培养基更换为适用于阳离子脂质体转染的Opti-MEM减血清培养基。同时,准备转染试剂,包括Lipofectamine 3000、助转剂P3000以及含有CRISPR-Cas9系统的质粒。 5、转染操作:将质粒混合物与转染试...
1、转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。 2、 取出制备好的Cas9表达慢病毒(pLV-Cas9-Puro包装得到,制备方法见Cas9慢病毒包装实验),室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液: 以感染1个12孔板细胞(细胞培养基体积1ml)为例 病毒液 50ul 细胞完全培养基到950ul 加入Polybrene...
图9. GSPure® Circ-eGFP转染293T细胞后荧光检测结果（放大倍数：100×）图10. GSPure® Circ-mCherry转染293T细胞后荧光检测结果（放大倍数：100×）肌肉注射LNP包封 Circ-Fluc至Bal/bc小鼠，通过体内验证、筛选不同IRES序列、优化密码子序列，提高circRNA翻译效率，满足不同药物开发的需求。图11. 肌肉注射LNP...
293t-spcas9细胞是用293t细胞构建的稳定表达spcas9蛋白(c端有nls信号)的细胞株。在转入sgrna表达质粒或者化学合成的sgrna后可以对细胞基因组dna进行定点切割。也可以配合验证载体ptyne载体实现对基因敲除靶点的筛选和验证。 细胞特性:表达基因:野生型spcas9,c端nls信号基因导入方法:慢病毒筛选抗生素:puromycin细胞克隆:...