与其他RNA引导的效应物一样，Cas12a依赖于R-loop内的种子区来促进有效的靶标识别和区分错配序列。在该研究中，接触5 bp种子区的Cas12a的第一个结构显示，置位NTS的前三个核苷酸被PAM相互作用（PI）结构域捕获，REC1结构域向外移动以适应A型异源双链体的形成。大多数接触集中在 R-loop的前几个碱基对内，由WE...
Cas12蛋白只需要识别crRNA就能有效切割单链DNA和双链DNA。Cas12蛋白的RuvC和核酸酶叶(NUC)结构域具有裂解活性。与Cas9相同，Cas12a在PAM（5’-TTTV-3’， V为A/C/G）序列旁边存在一个潜在靶点，一旦与Cas12相遇，就可以启动R-loop，在crRNA和目标DNA链之间形成碱基对杂交，匹配目标序列的1～17个碱基对，形成R...
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统，该系统发挥功能包括三个阶段：第一阶段是适应，细菌通过特定Cas蛋白从入侵的核酸中识别PAM位点（原间隔序列相邻序列）并将原间隔序列整合到细菌自身的CRISPR序列中；第二阶段是表达和成熟，CRISPR转录为pre-crRNA（RNA前体物），通过酶加工为...
“CRISPR/Cas12a”是一种新型的RNA引导的核酸内切酶,可以作为“CRISPR/Cas9”系统的替代工具,该系统主要包含crRNA和Cas12a蛋白两部分,crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列,从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图1表示两种系统工作原理示意图,PAM是Cas蛋白识别和结合的一段短核苷酸序列,是目标DNA的sgRNA或crRNA与...
Cas9靶向DNA序列的PAM为5’-NGG-3’,位于非目标链间隔序列下游。Cas9核酸内切酶包括一个HNH核酸酶结构域和一个RuvC-like核酸酶结构域,两个结构域都用于切割DNA,其中HNH核酸酶结构域切割与crRNA互补的DNA链,而RuvC-like结构域切割另一条非互补链,切割位点为PAM上游原始间隔序列第3和第4个核苷酸之间,产生平末端的DSB...
因此,CRISPR Cas12a蛋白诱导具有可变长度的5'突出端的PAM远端切割。值得注意的是,CRISPRCas12a蛋白在种子区域外切割,而Cas9在其种子区域内切割。正因为如此,Zetsche等人提出Cas12a的DNA切割可以耐受由非同源末端连接NHEJ方式产生的小插入缺失,导致多轮双链断裂形成,因此增强了 ...
Cas12a的特异性是由crRNA和DNA靶标之间的互补性、DNA靶标旁边的原间隔短回文序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）两个主要因素决定。尽管Cas12a的特异性已经被广泛研究，但许多体外研究是在高镁离子浓度下进行的，这可能与细胞内实际的游离Mg2+浓度不一致。为了解决这个疑惑，研究人员通过在一系列Mg2+浓度下...
一旦R-loop形成,Cas12a蛋白利用其活性RuvC结构域,在PAM序列的帮助下切割非目标链。Cas12a蛋白的切割功能被激活后,会切割周围的非特异性单链DNA,这种现象被称之为反式切割。 图3. CRISPR/Cas12机制示意图。图片来源:Swarts DC al et, 2017 与Cas9产生平末端相比,Cas12a产生交错粘性末端可能更有利于以精确方向...
Cas12a又称为Cpf1,Class 2类CRISPR系统,与Cas9一样通过识别特异性PAM序列行使核酸内切酶功能从而产生DNA双链断裂。与Cas9系统在crRNA加工、PAM识别机制、切割方式等方面存在明显不同(表1)。Cas12a因其独特的作用机制,在基因编辑和核酸检测领域大放异彩。小编将从以下几个方面介绍Cas12a系统的独特之处: ...
在该研究中,接触5 bp种子区的Cas12a的第一个结构显示,置位NTS的前三个核苷酸被PAM相互作用(PI)结构域捕获,REC1结构域向外移动以适应A型异源双链体的形成。大多数接触集中在 R-loop的前几个碱基对内,由WED (Wedge)和PI结构域形成。REC1结构域很少与种子末端的R-loop产生非特异性稳定接触(K51, N175, R...