1类CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌当中最为常见,所占比例在所有已鉴定CRISPR-Cas基因座中高达90%。2类CRISPR-Cas系统包括剩余的10%几乎只存在于细菌中,并组装成一个核糖-核蛋白复合物,由crRNA与Cas蛋白组成,crRNA包含靶向特定DNA序列的信息。 目前所流行的Cas9与...
在机制上，与Cas9蛋白不同，Cas12a蛋白不需要tracrRNA进行pre-crRNA加工，也不需要RNaseIII。Cas12a的WED结构域中存在核糖核酸酶位点，允许将pre-crRNA自主加工为成熟的crRNA。Cas12a的crRNA明显短于Cas9向导RNA（sgRNA或crRNA+ tracrRNA）。这允许紧凑的Cas12a CRISPR阵列，可用于同时靶向多个位点。Cas12蛋白只需要识别cr...
3. crRNA与CAS12a的结合会引起CAS12a构象的变化,其中REC1和WED结构域会发生向REC2靠拢的构象重排。这有利于REC1和REC2结构域之间的相互作用,激活CAS12a的内切酶活性。4. crRNA通过其重复序列的32nt与CAS12a的REC1结构域的9个α螺旋进行的互补配对而结合。crRNA的SPACER序列剩余部分则伸出CAS12a表面,用于识别靶DNA。
对Cas12a酶的金属离子依赖性进行实验，其结果表明Cas12a的第二链切割步骤在低Mg2+浓度下受到显著影响，尤其是对于AsCas12a，这表明Cas12a的切割活性具有金属离子依赖性。这些研究结果揭示了Mg2+浓度的变化对Cas12a的特异性有显著影响，在低Mg2+浓度下，Cas12a对PAM近端的突变更加宽容，而对PAM远端的突变则宽容度降低。
Cas12a复合物识别的PAM序列是TTTV(V=A,C,G),这一特征弥补了Cas9的不足,当某一基因中富含A,T序列时,Cas12a就能发挥强大的作用,与Cas9不同,Cas12a切割的位置是PAM序列的远端,所形成的是黏性末端,5'端有5个核苷酸悬挂出来。另外Cas12a的切割结构域只有一个RuvC结构域,它在远离PAM序列处依次切割,这也是为什么Ca...
一、Cas12a在切割过程中的结构 为了捕获R-loop形成过程中 WT Cas12a 的各种中间体，研究人员将WT Cas12a 和与crRNA具有不同互补序列长度的靶标DNA 底物一起孵育并获取冷冻电镜图。从中，研究人员获得了六个不同的R-loop中间结构，标称分辨率范围为3.3至3.7 Å。冷冻电镜结果中WT Cas12a的这些结构描述了R-...
1. 核酸酶结构域不同，Cas12b蛋白的结构域是RuvC；Cas12a蛋白的结构域是RuvC和Nuc。2. 向导RNA不同。Cas12b需要crRNA和tracrRNA；Cas12a只需要crRNA，不用tracrRNA。3. 酶切方式不同。Cas12b酶切7个交错核苷酸；Cas12a酶切的是交错末端，5' overhangs。4. 应用技术不同。Cas12b蛋白应用的技术是HOLM...
Crispr cas12a是一种可编程的DNA内切酶，它可以根据crRNA的设计实现对不同DNA的精确识别与切割。在靶DNA的指导下，Cas12a核酸酶域会被激活并进行DNA内切，实现了对靶DNA的高效识别和放大。这一原理使其可以作为DNA诊断工具，crRNA的设计决定了其特异性。但Cas12a附带切割效应也使非特异性信号放大成为可能，这需要在...
在基因编辑领域,Cas12a作为Cas9的极大补充,具有以下优势: 拓展编辑位点:Cas12a识别富含T的PAM序列,能够在富含AT基因组的物种中进行基因编辑(例如斑马鱼等)。 提升编辑效率:Cas12a在切割序列后产生交错粘性末端,提升同源重组修复(HDR)效率,降低脱靶效率。 成本更经济:Cas12a的crRNA在40-44nt左右(包含20nt的恒定区和...
图1 定点修饰Cas12a共价偶连crRNA提高Cas12a系统基因组编辑效率 作者首先基于Cas12a的晶体结构，利用基因密码子扩展技术将含有叠氮基团的非天然氨基酸定点引入了Cas12a蛋白中，其与末端修饰DBCO的crRNA偶连可以实现共价Cas12a复合物（conjugated Cas12a, cCas12a）制备，并证明在特定位点偶联的复合物不会影响编辑。在细胞...