将crRNA中的部分核苷酸替换为类似物Locked核苷酸,其中糖环构型被锁定,这可以显著提高crRNA的稳定性。4. 增强内源性RNA酶抗性。在crRNA关键位点引入化学修饰以抑制内源性RNA酶对关键位点的识别和切割,从而增强crRNA的稳定性。5. 5'帽和3'多聚体修饰。在crRNA的5'端加上7-甲基鸟苷帽或者在3'端加上一条聚A尾巴,...
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统，该系统发挥功能包括三个阶段：第一阶段是适应，细菌通过特定Cas蛋白从入侵的核酸中识别PAM位点（原间隔序列相邻序列）并将原间隔序列整合到细菌自身的CRISPR序列中；第二阶段是表达和成熟，CRISPR转录为pre-crRNA（RNA前体物），通过酶加工为...
1类CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌当中最为常见,所占比例在所有已鉴定CRISPR-Cas基因座中高达90%。2类CRISPR-Cas系统包括剩余的10%几乎只存在于细菌中,并组装成一个核糖-核蛋白复合物,由crRNA与Cas蛋白组成,crRNA包含靶向特定DNA序列的信息。 目前所流行的Cas9与...
crRNA内的间隔区对特定靶RNA具有特异性，并介导其识别。处理后，成熟的crRNA包含DR和间隔区。在靶标RNA被Cas13:crRNA复合物识别并结合之前，基本不具备裂解活性。与靶RNA形成三元复合物后，构象重排随之发生，从而使crRNA：靶RNA杂交体完全被核酸酶核心包围，并且催化激活核酸酶。在crRNA内，可以识别一些子区域，其中之...
crRNA的设计是cas12a基因编辑过程中的重要一环。它由人工合成或细胞中的sgRNA生成,长度通常在70-90个核苷酸之间。理想的crRNA结构应具备序列保守性、稳定性及与靶标DNA序列的有效匹配性。通常,我们会将特定数量的尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)放在crRNA的前端,用于与靶标序列的启动区域进行配对。三、crRNA的长度设计crRNA的...
2016年,科学家发现了可以靶向RNA进行切割的CRISPR/Cas13系统,该系统由单一的效应蛋白Cas13和CRISPR RNA(crRNA)组装形成一个由crRNA引导的RNA靶向效应复合物。目前,Cas13家族共鉴定出四种亚型,包括Cas13a(又名C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d,四种Cas13亚型蛋白分子量均小于Cas9蛋白。所有Cas13蛋白均具有两种不同的...
一、探索不同长度U延伸及化学修饰对crRNA性能的影响 研究人员选择了一个常用的crRNA进行工程化，通过在crRNA的3′或5′端增加不同的尿嘧啶（U）数量或通过化学修饰来提高Cas13a的转切割活性。实验结果显示，5′端3U延长的crRNA显著增强了LbuCas13a的反式切割活性，而3′端3U的延长则降低了活性；用PS-2′-OMe分别...
Cas蛋白是发挥识别、切割功能的蛋白,crRNA为靶向指引,PAM是CRISPR/Cas系统区分自我和入侵者的标记。Cas12a蛋白由1200~1300个氨基酸组成,略短于SpCas9(来源于Streptococcus)的1368个氨基酸。Cas12a具有两个瓣叶结构:核酸酶瓣叶(nucleaselobe,NUC)和α-螺旋识别瓣叶(alpha-ahelixrecognitionlobe,REC)。
目前有多种提高CRISPR系统检测能力的方法,比如:将RNA结合域融合到Cas13a活性位点、设计发夹报告器、整合单个核酸不同核苷酸区域的多个crRNA,以及crRNA工程化改造等。crRNA工程化是最简单经济的方法,已被用于提高Cas9和Cas12a核酸酶的顺式切割活性,从而提高基因编辑的效率和特异性,但迄今为止还没有报道使用工程化crRNA来...
第1类CRISPR-Cas系统包含多蛋白效应复合物,第2类系统只有一个效应蛋白; CRISPR-Cas系统依赖于CRISPR RNA (crRNA),向导RNA (gRNA)指导和目标特异性杂交(图1),定位到PAM或PFS序列,Cas核酸酶切断目标核酸。因此,任何包含PAM或PFS的位点特异性切割都可以通过设计c...