最后,为了进一步提高安全性,将表达CAR分子的目的基因、rev基因、gag和pol基因及VSV-G基因分别用4个质粒携带,慢病毒包装只需把上述4个质粒共同转染到293T细胞中,三个质粒分别表达病毒复制组装需要的元件,病毒就这样在293T细胞中包装出来了。 ▲图5. 慢病毒载体包装过程 慢病毒包装质粒的生产 常用的慢病毒包装质粒生...
被细胞摄取后,NC 的核酸会从内含体中逸出,从而进入细胞。已有学者报道含有质粒或者体内转录 mRNA 的 NC。质粒 DNA 可通过与 PBAE 载体材料共价连接的核定位-微管相关信号肽(NLS-MTAS)定向到细胞核。当转座酶(如PiggyBac)的表达质粒与转基因质粒共传递...
最后,为了进一步提高安全性,将表达CAR分子的目的基因、rev基因、gag和pol基因及VSV-G基因分别用4个质粒携带,慢病毒包装只需把上述4个质粒共同转染到293T细胞中,三个质粒分别表达病毒复制组装需要的元件,病毒就这样在293T细胞中包装出来了。 ▲图6. 慢病毒载体包装过程 3 慢病毒包装质粒的生产 常用的慢病毒包装质...
质粒基因转导 使用转座子或者转座酶系统对CAR基因进行转导是一种比较新的方法。转座子是一段DNA序列能够通过转座酶切割和插入。CAR基因序列可以插入到质粒的转座子上。质粒在T细胞活化之前电转到T细胞中,之后转座酶切割含有CAR的转座子,然后插入到T细胞的基因组中。...
提起慢病毒包装，好多人只知道质粒共转染293T细胞，又或者对穿梭质粒、辅助质粒傻傻分不清楚，那么现在就从慢病毒的基因组入手，讲解一下病毒包装的原理：首先它的基因组可以分为三个编码病毒基本结构的【结构基因】：gag、pol、env；六个【调节基因】：tat、rev、nef、vif、vpr、vpu。但后来大家发现６个调节基因中...
❸ 四质粒系统 与三质粒系统相比,第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上;第二个变化是将tat基因去除,并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以启动载体质粒的表达,虽然更安全,但滴度不如三质粒系统高,目前部分实验室在用。 通常,三质粒系统能够兼容四质粒系统的transfer 质粒,反之则不可以...
❶两质粒系统 以HIV-1为骨架,将其中的反式作用蛋白基因序列去除,然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒,共转染包装细胞(如293T细胞)进行包装。但这个系统由于存在产生野生型HIV的危险,现在已经不再使用。 ❷三质粒系统 ...
接下来,科研人员采用共转染技术,将这三个包装质粒和一个表达质粒瞬间导入到293T细胞中。这些293T细胞经过特殊培养,具备接受外源基因并按其指令进行复制和表达的能力。通过这一步骤,细胞内部开始大量产生携带表达质粒上基因信息的慢病毒载体。 为了从众多细胞中筛选出成功组装并高效表达慢病毒载体的细胞株,科研人员采用克...
目前慢病毒载体已从两质粒系统发展到四质粒系统，安全性不断提高。目前常用的是四质粒系统，有更广泛的应用，比如基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究、CAR-T细胞治疗等。慢病毒载体有更广泛的宿主，能够感染分裂和非分裂细胞。对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能极大的提高目的基因的...
首先需要通过将包装有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三个质粒导入宿主细胞，通过宿主细胞的细胞器复制/转录出病毒蛋白和所需的基因序列，并包装成携带CAR基因的γ-逆转录病毒载体。载体和活化的T细胞膜融合后，释放CAR基因，沿着微管被运输到细胞核（得益于核膜被破坏），并整合进T细胞基因组...