封闭时使用5%脱脂奶粉-TBST,摇床上室温封闭1h。如后续使用荧光发光法,则封闭时不可含有Tween® 20。二抗孵育时,也推荐用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗,降低背景。注意,需使用实验级脱脂奶粉(Nonfat Dry Milk #9999),食品级奶粉不可用于实验...
(PVDF)膜上;5%脱脂奶粉室温封闭90 min,PBST清洗封闭的奶粉后;加入Ⅰ抗抗体并置于小型摇床上4 ℃孵育12 h,回收Ⅰ抗后,PBST清洗3次,每次10 min;加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗,室温孵育2 h,然后PBST洗脱Ⅱ抗,每次10 min;最后EC...
用 PBS/Tween 0.05% (PBS-T) 中的 5% 脱脂牛奶封闭印迹 2 小时,并用含有 0.05% PBS-T 和 5% 脱脂奶粉 (4°C,过夜)。洗涤(PBS-T)后,印迹用辣根过氧化物酶缀合的二抗处理 1 小时,并在 PBS-T 中洗涤(5 次,持续 5 分钟)。通过增强的化学发光系统(Geneflow,Staffordshire,UK)检测蛋白质。 p21 和 B...
5 曝光；6 灰度值统计分析。一、待测蛋白的准备 1. 细胞蛋白的提取：（1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上放置10分钟裂解。（2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用...
原因:实验操作与 CST 推荐的步骤有较大出入。 建议: CST 推荐封闭液用 5% 脱脂奶粉/TBST,室温 1 h; 一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书,推荐 4 ℃ 过夜孵育; 二抗用 5% 脱脂奶粉/TBST 稀释,工作浓度切忌过高,室温孵育 1 h; 要用1XTBST 缓冲液充分洗涤。
用蛋白裂解液提取股骨组织蛋白,BCA试剂盒定量蛋白浓度,在10% SDS-PAGE凝胶上蛋白样品进行电泳后进行转膜,4 %脱脂奶粉封闭2 h,一抗[GAPDH (1∶5 000)、FNDC5 (1∶1 500)、Wnt3a (1: 5 000)、β-catenin(1∶1 500)] 4℃孵育过夜,二抗(1∶5 000)室温孵育2 h, ECL显色,全自动发光仪显影后使用Image...
1.2.7重组蛋白Western blot分析 取纯化蛋白样SDS-PAGE电泳将蛋白转移到经甲醇活化的PVDF膜上,转膜完成后以TBST洗PVDF膜多次,加入5%脱脂奶粉封闭1 h,以20例过敏患者混合血清为一抗在4 ℃恒温条件下孵育过夜。加入Mouse Anti-Human IgE Fc-HRP为二抗,TBST洗膜去除未结合的二抗。ECL超敏发光试剂,在化学发光成像仪观...
答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点。 26、问一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗? 答:Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都...
5%脱脂奶粉封闭1小时,并且然后用KPL洗涤溶液洗涤三次。在封闭缓冲液中制备来自 狗或人的血清的连续稀释液,并且将这些连续稀释液在室温下孵育1小时。将板洗涤三次 并且用1 : 2, 000稀释的第二抗体,辣根过氧化酶(HRP)共轭的山羊抗狗IgG(圣克鲁斯公 司(Santa Cruz),加利福利亚洲)或山羊抗人IgG(KPL公司,盖瑟斯堡...