4.细胞抗性：G418浓度越高，细胞抗性越强。在低浓度G418下，细胞对G418的敏感性较高，细胞容易死亡。随...
准备多组六孔板，每孔铺适量且等量 293T 细胞（约 5×10⁵个 /mL），待细胞贴壁、状态良好（24 小时后），分别加入含不同浓度 G418（如 200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL）的完全培养基，每日观察细胞形态与存活状况。通常，4 - 7 天内，合适浓度下未转染抗性基因的细胞会大量死亡、脱落...
4.细胞抗性：G418浓度越高，细胞抗性越强。在低浓度G418下，细胞对G418的敏感性较高，细胞容易死亡。随...
准备多组六孔板,每孔铺适量且等量 293T 细胞(约 5×10⁵个 /mL),待细胞贴壁、状态良好(24 小时后),分别加入含不同浓度 G418(如 200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL)的完全培养基,每日观察细胞形态与存活状况。通常,4 - 7 天内,合适浓度下未转染抗性基因的细胞会大量死亡、脱落,而留存细...
克隆挑选时机:筛选约 10 - 14 天后,抗性克隆清晰可见,挑选时用无菌移液器头小心吸取,移至新孔扩增培养,过程轻缓防损伤细胞,后续经 PCR、蛋白免疫印迹等验证克隆基因整合与表达,确保筛选成功。 掌握精准浓度与严谨操作,才能借 G418 高效筛选出理想的 293T 抗性细胞株,为基因功能、重组蛋白表达等研究筑牢基础。
一、G418筛选293T细胞的工作原理 G418是一种新霉素类抗生素,通过干扰细胞内蛋白质的合成,从而导致细胞死亡。但是,带有新霉素抗性基因的细胞可以产生抗性蛋白,从而抵抗G418的毒性。因此,在含有G418的培养基中,只有带有新霉素抗性基因的细胞能够存活和生长。
抗性基因：293FT细胞还稳定表达新霉素抗性基因，这使得它可以在含有0.5 mg/ml G418的培养基中维持培养。综上所述，293T和293FT细胞都是基于HEK293细胞系的重要实验工具，它们在基因表达、蛋白生产以及病毒包装等领域发挥着不可替代的作用。然而，它们在某些方面（如细胞特性、转染效率及稳定性）也存在差异，实验人员...
293T-TYNE细胞采用嘌呤霉素筛选得到,表达嘌呤霉素抗性基因,而HEK293T细胞本身对G418有较高抗性,因此后续细胞筛选实验中不能采用这两种抗生素。 一般切割成功后48h能检测到绿色荧光,延长检测时间至72小时荧光更加明显。 靶点设计务必位于两个ATG起始密码子之后、EGFP编码序列之前。
293t-spcas9细胞采用嘌呤霉素筛选得到,表达嘌呤霉素抗性基因,而hek293t细胞本身对g418有较高抗性,因此后续细胞筛选实验中不能采用这两种抗生素。 cas9蛋白需要grna配合才能对定点切割细胞基因组。单独使用不能发挥基因敲除或者编辑作用。配套的grna表达载体有pgr系列载体和pgr-egfp系列载体。293t-spcas9细胞推荐用pgr-hygr...
抗性标记:选择与您实验体系兼容的抗性标记,例如G418、Puromycin等。 Q2: 如何验证稳转细胞株的表达? A2: 可以通过以下方法验证稳转细胞株的表达: Western Blot:检测目标蛋白的表达水平。 qPCR:检测目标基因的mRNA表达水平。 荧光显微镜观察:如果目标蛋白带有荧光标记,可以直接观察荧光表达情况。 Q3: 稳转细胞株可以传代...