7. 酶切体系尽量选择较大体系，如50 uL、100 uL等。限制性内切酶保存在甘油中，甘油会影响很多限制性内切核酸酶的特异性，这是导致一些酶产生星号活性的主要原因之一,因此酶切反应体系中甘油的浓度尽量小于5%。大体系能稀释甘油浓度，对反应有利。相反，连接尽量用小体系10 uL或20 uL，以增加DNA末端的碰撞机会。...
酶切体系主要由以下几部分组成:首先是酶,通常使用的是限制性内切酶,它可以识别特定的核苷酸序列,并在这些位点上切割 DNA 分子。其次是底物,通常是 DNA 分子,可以是纯化的 DNA 片段,也可以是全基因组 DNA。此外,还需要缓冲液,用于维持反应的 pH 和离子浓度。 酶切体系广泛应用于分子生物学实验中,比如基因克隆、基...
而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物(50体系)约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的质量好,酶切完全切得动。 2连接反应: 连接酶说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6 μg...
NotI和Sal I双酶切体系鉴定 依DNA量定体系 20µl 10µl 10µl 10µl 30µl 40µl 灭菌去离子水 8.5 4.3 - 2 6 2.4 10×buffer D 2 1 1 1 3 4 BSA(10µg/µl) 0.2 0.1 0.1 0.2 0.6 0.6 DNA(1µg/µl) 8.3 4 7.9 6 18 30 Not I(10U/µl) 0.5 0.3 0.5 0.4 ...
酶切体系是指将RE、DNA模板、缓冲液等试剂混合在一起进行反应的体系。构建酶切体系时,需要考虑RE的种类、浓度、反应时间、温度等条件。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术,通过观察DNA条带的位置和数量,可以判断酶切反应是否成功。 三、实验材料 1. 试剂:限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA分...
酶切的质粒以及酶切位点的选择 从这个质粒的图谱可以看得到我的质粒大小是4.4K,选择这两个酶切位点以后,酶切大小片段应该是约为400bp和4000bp左右,预期应该是2条带。 实验预期总是很美好,现实bug太多了! 上胶图: 酶切体系为10ul,质粒总量为500ng左右,加了1ul酶,37度水浴3h,取了5ul体系跑胶 ...
因为内切酶的酶活性单位定义是在50ul反应体系中,最适温度反应1小时能够讲1ugDNA完全酶切的酶量.所以,一般在酶切体系里,DNA的量是可以加到非常大的.因为考虑到后期的纯化后DNA的损失问题,所以推荐酶切体系中的DNA尽量多加一些.这样你纯化回收后的DNA剩下的就比较多,有利于后期的连接以及筛选.具体的话,我经常做的...
二、单酶切 1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入: (1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。 (2)限制性内切酶:1 μL(约10 U)。 (3)10×buffer:2 μL。 (4)ddH2O:补足20 μL。 2. 混匀,做好标记。 3. 37℃水浴1-3 h。 4. 70℃水浴10 min中止反应。 5. 电泳检测酶切效果。 酶切体系:(37℃/3h...
不过,对于一般的体系,可以选择10微升体系或20微升体系.具体是1/10体积的buffer,酶的总体积控制在1/10以内,比如10微升体系酶量不要超过1微升,20微升体系不要超过2微升.DNA加入1~1.5微克即可.用水补足体积. 34804 酶切体系 1.是2*102.分别是50/10=5,50/5=10,50/2=25.一般来说几×就是对buffer稀释几倍...
酶切体系的建立一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1卩g不同来源和纯度的DNA通常,一个50卩I的反应体系中,1卩I的酶在1XNEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1卩g已纯化好的DNA如果加入更多的酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量,对许多酶来...