膜蛋白酵母双杂交:DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上,巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)进行蛋白质相互作用的筛选;泛素作为降解信号分子,人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub),互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。 本文仅代表作者观点,不代表...
选择标记基因 (Selectable Marker Gene):可以筛选出成功转化的酵母细胞,如 LEU2 基因或 URA3 基因。 酵母双杂交技术的原理是将待检测相互作用的两个蛋白质分别融合在BD和AD上,共转化入酵母细胞中。如果这两个蛋白质能够相互作用,则BD和AD会被连接在一起,重建完整的转录激活因子功能,激活报告基因表达。根据报告基因...
2、双向酵母双杂交实验鉴定蛋白质间的相互作用 2.1酵母转化中DNA 混合液的配制 在制备酵母感受态的过程中配制下面的DNA 转化混合液(1×): 2.2酵母感受态细胞的制备以及共转化 下面是所需用量为10 个转化实验的酵母感受态细胞的制备。 (1) 挑取平板上AH109 酵母细胞的单个克隆至5 ml YPD 培养基中,30℃ 摇床振摇...
1、阳性克隆的筛选 2、用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆 3、酵母杂合试验确定真阳性克隆 4、阳性克隆的进一步筛选和确证 5、对双杂交系统阳性结果的进一步研究 6、阳性克隆的筛选 7、用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆 8、酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性...
图1.酵母双杂交技术原理(图片来源于网络) 目前酵母双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和 Gal4 系统两种。在 LexA 系统中,DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白 LexA 构成,转录激活结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42 构成,它在酵母中可以活化基因的转录;在 Gal4 系统中,BD 和 AD 分别由 Gal...
具体实验步骤如下:1.构建酵母表达载体:将含有自身复制元件2μ、酵母转录起始序列、选择性筛选的标记基因等元件的酵母表达载体与感兴趣的蛋白质基因融合,在表达载体中得到融合基因。2.构建Gal4转录因子启动子激活报告基因的表达载体:将报告基因与Gal4转录因子启动子串联,在表达载体中得到表达Gal4转录因子...
1. 将表达的靶蛋白与预测蛋白的质粒转化到已经筛选完成的酵母菌株中。 2. 筛选出包含了表达蛋白与预测蛋白相互作用的克隆。 四、验证 1. 验证通过筛选的靶蛋白与预测蛋白是否真的相互作用。 2. 进行进一步的验证,如生物学功能实验。 酵母双杂交技术在生物学研究中被广泛应用,其中包括蛋白质相互作用的研究...
1.将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒;2.将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中,选择被转化的酵母;3.再将文库质粒转化到酵母中;4.通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。
酵母双杂交系统是一种用于研究蛋白质间相互作用的技术,其操作步骤如下:首先,为了构建诱饵,将待研究的基因与Gal4、LexA或其他合适的蛋白的DNA结合域融合,然后将这一融合片段整合到诱饵质粒中,形成实验所需的分子探针。接着,将这个诱饵质粒导入到一种特定的酵母细胞株中,这种细胞已经被设计为缺乏表达...