一、准备质粒和感受态 如果是干粉质粒，5000rpm离心1min，加入无菌水（或者拿提质粒的试剂盒里的TB buffer）溶解。从-80℃拿出感受态，放置于冰上融化。加入2ul质粒，不用吹打，轻轻操作，避免震荡。在冰上静置30min。二、热激 42℃ 30s，之后冰上静置2min。原理：热冲击导致细胞膜流动性增加，让细胞膜暂时变得可...
2) 取1 μL纯化后的质粒于一个1.5 mL的离心管中,将其和0.1 cm的电极杯一起置于冰上预冷; 3) 将40-100 μL解冻的感受态细胞转移至此1.5 mL的离心管中,小心混匀,冰上放置10 min; 4) 打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1 KV; 5) 将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入...
1、从-80°C冰箱中取出感受态细胞,放置在冰上解冻。 2、用枪头吸取5μl质粒,加入到50μl感受态细胞中,轻轻混匀。 3、将混合物放置在冰上静置30分钟,每10分钟轻轻弹动几次以混匀。 4、将混合物在42°C水浴中静置90~120秒,然后迅速放入湿冰中静置5分钟。加入等体积的SOC培养基,37°C静置30分钟。 5、预...
以下是质粒转染实验的一般步骤：一、准备细胞和质粒1. 准备适合的细胞系，处于对数生长期，并进行细胞传代培养。2. 准备好要转染的质粒，通常为DNA片段，进行浓度测定和质量检测。二、质粒转染试剂选择根据细胞类型和实验目的选择适当的转染试剂。常见的转染试剂有脂质体、阳离子聚合物和病毒载体等。三、细胞处理 1. ...
下面以最常用的脂质体介导的贴壁细胞转染为例，介绍其操作步骤：转染前准备 ①细胞培养 选择处于对数生长期、生长状态良好的贴壁细胞，提前 1 - 2 天接种到培养板中，使转染时细胞汇合度达到 70% - 90%。细胞培养使用含血清、抗生素的完全培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养。②试剂准备 质粒 DNA：确保...
1. 从-80℃和-20℃分别取出感受态细胞和质粒,置于冰上解冻。 💙 若质粒为冻干粉末,可用无菌水或TE buffer稀释至100ng/ul。 💙 感受态细胞刚溶解时转化效率最佳,建议不超过3分钟。 2. 取1-10ul质粒,轻轻加入到感受态细胞中,轻拍管底或用枪头轻轻搅拌混匀。 💙 注意不要吸打,以免损伤感受态细胞。 💙...
质粒转化的步骤 1. 准备受体细胞 转化前需准备适当的受体细胞，如大肠杆菌等。受体细胞需处于易于接受外源DNA的状态，通常通过培养细胞至对数生长期来实现。同时，要确保细胞不受抗生素等影响，以免影响转化后的筛选。2. 质粒的准备与处理 提取的质粒需经过纯化，去除杂质，以保证转化效率。通常采用钙离子...
1、种细胞 a、贴壁细胞：转染前一天每孔0.5-2×10E5个细胞接种于500ul培养基中，在转染时细胞可长至90-95%汇合度。b、悬浮细胞：在配置转染液前每孔4-8×10E5个细胞接种于500ul培养基中。2、转染液配置，每孔细胞用量如下：A. 用50ul无血清培养基稀释质粒DNA，轻轻混匀。B. 取适量合适的质粒转染试剂在...
在进行质粒转化之前，需要包括细胞解冻和质粒溶解步骤，为高效转化奠定基础。若感受态细胞存于-80℃冰箱中，需先取出并迅速在室温下解冻。解冻后，应立即将细胞置于冰浴中孵育，以减缓温度变化对细胞的潜在损害。质粒溶解是进行后续实验的关键步骤。通常，质粒以粉末状保存，在操作时，取适量质粒，加入10微升的无菌缓冲...
质粒构建是质粒转化的第一步，主要是将目标基因插入到质粒载体上，构建成适合转化的质粒。下面是质粒构建的基本步骤：1.购买或从他人提供质粒载体：质粒载体通常是一种环状DNA分子，能够自我复制并带有一些重要的功能元件，例如起始子、选择性标记和载体复制起始位点等。2.选取适当的限制性内切酶：根据质粒载体上的限制性...