在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。 Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT,以维持蛋白的还原性。 Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。 ➤所以跑大分子蛋白时,我们...
通常WB实验中每孔上样量为30-50μg,80%蛋白在细胞中的含量很低,当蛋白分子量过小时,上样量建议选择50-100μg。毕竟对于小分子的蛋白来说,在跑电泳时,稍不留心,蛋白就跑没影了。 ② 凝胶浓度选择 分子量越小的蛋白,需要的凝胶浓度越高,反之亦然。 如果是商品化的凝胶试剂盒通常各个厂家针对不同的浓度的凝...
一般的脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白,是一种磷酸化蛋白,如果要WB检测磷酸化蛋白的话,就最好别用脱脂奶,否则会产生高背景(当然很多人用牛奶封闭出现问题也可能是因为用了非实验级奶粉)。根据经验来看,WB检测磷酸化蛋白时,BSA的封闭效果比脱脂牛奶好。 ③抗体孵育 一抗4 ℃过夜,二抗室温1 h 因为磷酸化蛋白只占总蛋...
选择适用于小分子蛋白的marker,这样在敷抗体时可以更清楚地裁膜。电泳开始前,可以用1´loading buffer补齐未点样的胶孔,防止两边不齐跑成“八”字。3️⃣ 电泳: 在浓缩胶部分设置恒压70V、30分钟左右,使蛋白浓缩到一条线上后,调大电压至110V,直至所需蛋白区域全部分开。避免长时间低电压跑胶,以防蛋白弥...
小分子蛋白WB,这样跑! 有小伙伴问我,小分子蛋白的Western Blot怎么跑。作为一个经常跑15KD、12KD、20KD蛋白的老手,我来分享一些我的小经验吧。 选择合适的聚丙烯酰胺凝胶 🧪 选择对的胶是关键!小分子蛋白的marker千万别跑到胶的最下面。比如,你要跑12KD的蛋白,选择10KD和15KD、20KD分得开的胶会更好。如果...
小分子蛋白跑Western blot（WB）时有什么需要注意的地方？一般来说分子量越小的蛋白条带越易呈现出向四周弥散的趋势，甚至最终看不到条带，其原因是分子量越小的蛋白所能结合到的SDS也就越少，在电场作用下，蛋白向前迁移过程中会向四周弥散，最终呈现不出相应的蛋白条带。可以参考以下方法解决：（1） 一般20kd...
很多科研新手都说实验入门难,往往是没有掌握实验原理,缺乏科研框架性思维。在这本书里,我们不仅为大家总结了超级详细的WB、PCR引物设计、RNA抽提、免疫组化等入门实验protocol,还为大家准备了常用的实验方法,包含表型确认、分子机制、细胞交互等...
提前配胶和现配现用,跑着有区别吗?今天在一个WB交流群里看到有小伙伴在讨论这个问题,提前配胶和现配现用两种方式都有测试过。 今天就以上问题综合个人和身边同学的实践经验做一个简短分享。 提前配胶 优点:可以批量配,配一次,跑几天,方便,省时省事。
Western blot技术(简称WB)是一种广泛用于检测蛋白质含量的方法,也被称为“免疫印迹”或“蛋白质印迹”。可以检测单个或多个特定蛋白质在混合物中的存在以及相对丰度。 Western blot实验流程示意图(图片来源于网络) Western blot技术的...
在WB（Western Blot，即蛋白质印迹法）跑胶过程中，如果内槽液漏了，可以根据漏液的严重程度采取以下措施：一、漏液不严重时 如果漏液不是很严重，一般在1个小时内不会使液体漏到短板下面，可以采取以下步骤：及时补液：每隔一段时间（如半小时）向内槽中添加适量的电泳液，以保持液面不低于玻璃板短板，确保电泳...