对LC-MS数据的进一步研究结果还表明,经过O-糖无糖基化的rhEPO蛋白形态在约8.2min的保留时间处洗脱。此外,这些LC-MS数据还表明rhEPO至少还有两种其它的O-联糖型,以及更多种C端截断的蛋白形态。由此,我们可以看出该工作流程的确可用于快速分析rhEPO的N-联糖基化,帮助我们获取关于占据率和异质性的信息。 结论 最近,...
应⽤纪要 重组⼈EPO N-联糖基化和O-联糖基化的全⾯ 表征 Matthew A. Lauber, Stephan M. Koza, Erin E. Chambers Waters Corporation 摘要 重组⼈促红细胞⽣成素(rhEPO)分⼦此前由于其糖基化结构相对复杂,⼀直被视为糖基化表征的难题,本应⽤纪要 介绍的两种简易策略可⽤于详细研究rhEPO的...
本发明涉及用于制备包含抗体序列或其片段的多肽的方法,所述多肽具有低 0-联糖基化程度,所述方法包括以下步骤a.提供编码包含抗体序列或其片段的多肽的核酸序列;b.修饰所述核酸序列从而将选自S、T和Y并且受到0-联糖基化的至少一个氨基酸残基取代或缺失;c.将所述经修饰的核酸序列导入合适的宿主细胞,从而使所述经修...
该分析方法所具备的色谱和质谱级灵敏度简化了N-糖指认过程,让分析人员能够轻松绘制rhEPO N-糖物质的N-糖谱图。 本研究分析所得的rhEPO N-糖谱图中主要包括具有不同N-乙酰乳糖胺延伸结构的四天线、四唾液酸化N-糖(FA4G4S4),但同时该谱图中也包括一个对应二唾液酸化双天线N-糖(FA2G2S2)的高丰度峰。由于四...
本应用纪要展示了两种可用于详细研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)的N-联糖基化和O-联糖基化的简易策略。在本研究中,我们首先快速释放rhEPO中的N-糖基,对其进行GlycoWorks RapiFluor-MS标记,然后利用灵敏的荧光检测和质谱检测技术进行亲水作用色谱(HILIC)分析。在接下来的平行分析中,我们利用完整...
本研究团队描述了一个用于定制糖结构的连续糖基化反应平台(SUGAR-TARGET),旨在通过一步固定/纯化法生产的固定化酶实现定制、可控的体外 N-连接糖基化。 糖基化是一种重要而复杂的翻译后修饰,它决定了蛋白质的生物和生理特性,如折叠、稳定性、活性和贩运。糖基化被定义为基于蛋白质的疗法的关键质量属性,因为它直...
通过对糖链结构的筛选得到转移效率最佳的二糖底物LacNac-Oxa(2C),同时研究发现在LacNac-Oxa的6号位进行改造并不影响Endo-S2的活性,因此对此位置引入叠氮基团或毒素分子,可以实现一酶两步偶联或一酶一步偶联,极大简化糖基化偶联的工艺步骤,并缩短反应时间,同时因为反应过程不会引入有机溶剂,工艺可开发性强,后续放大...
ADC的糖基化偶联技术不改变抗体的结构,无需进行抗体工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突变以便进行酶连,目前拥有糖基化偶联技术的公司也有多家,包括Syniffix,康宁杰瑞和糖岭生物等,但是具体使用的酶和linker接头均有所不同。 Syniffix两酶三步技术 ...
以几种方法将碳水化合物连接至糖肽,其中N-连接至天冬酰胺和O-连接至丝氨酸和苏氨酸对于重组糖蛋白治疗剂是最相关的。在所有真核细胞的分泌型和细胞表面结合型糖蛋白上均发现O-联糖基化。在通过O-联糖基化产生的结构中具有很大的多样性。通过存在于高尔基体中的数百种酶(糖基转移酶)的催化活性而产生此类聚糖。
Fig.1 靶向糖基化的人工高尔基体反应(SUGAR-TARGET)策略与设计 首先,作者在E. coli里表达了GnTI,GalT和SiaT,以细胞裂解液形式直接进行固定,3种酶在进行N-糖修饰时天然具有底物竞争(图 1)。GnT1产物GM5同时被ManII和GalT竞争。作者在蛋白N端融合表达麦芽糖结合蛋白(MBP)以改善溶解度,在C端融合表达AviTag,利用...