1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提时,打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 组织100m g ↓ 加1ml TRIzol ↓ 匀浆(要彻底,后转至EP管) (组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管) ↓ 颠倒混匀10下,室温5分钟 ↓ 4℃,离心12000g,15分钟 ↓ 转上层水相(约400μ...
估计到收集时长满),一般提取RNA作用时间不会太长,几个小时而已,所以细胞应长得接近饱和时加入药品,之后收集细胞,提取RNA步骤就一样了,提取的一孔RNA在10-20ug,这些已足够RT使用,具体提取方法站内有许多,
RT-PCR的基本步骤包括:A.A提取组织或细胞中的总RNAB.B采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNAC.C以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得
建议先将新鲜组织经液氮冻存后再提取,提组织RNA的东西比如研钵,镊子等都要200度干烤2小时去除RNA酶。你的RT-PCR结果不好,有可能是你提取的组织RNA不纯,或者RNA降解了。
两步法 RT-PCR (第一步:逆转录反应)试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μ l(11.5μ l) Oligo(dt)15 0.05μ g/μ l 4μ l(2μ l) 0.005μ g/μ l ↓混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV buffer 5× 8μ l(4μ l) 1× dNTP 10mM 2μ l(1μ l)...
两步法 RT-PCR (第一步:逆转录反应) 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μ l(11.5μ l) Oligo(dt)15 0.05μ g/μ l 4μ l(2μ l) 0.005μ g/μ l ↓ 混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV buffer 5× 8μ l(4μ l) 1× dNTP 10mM 2μ l(1μ...
以hela 为例,接种量在50万左右,待细胞长到90%时加药品(加入时间一般以你的作用时长为基点,估计到收集时长满),一般提取RNA作用时间不会太长,几个小时而已,所以细胞应长得接近饱和时加入药品,之后收集细胞,提取RNA步骤就一样了,提取的一孔RNA在10-20ug,这些已足够RT使用,具体提取方法站内有许多,搜索就可以了...