⑤ 点板:ddH2O+cDNA模板预混液,8μl/孔,加入RT-PCR反应孔底部。正向引物+反向引物+SYBR Premix+ROX Reference Dye II预混液,12μl/孔,加入RT-PCR反应孔左侧面。 ⑥ RT-PCR反应孔,1000g,4℃离心5min。 (12) 进行RT-PCR反应调整Applied Biosyste...
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提时,打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 组织100m g ↓ 加1ml TRIzol ↓ 匀浆(要彻底,后转至EP管) (组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管) ↓ 颠倒混匀10下,室温5分钟 ↓ 4℃,离心12000g,15分钟 ↓ 转上层水相(约400μ...
6、(实时定量(实时定量PCR) 用特异性引物以及荧光染料扩增目的基因,通过荧光信号检测用特异性引物以及荧光染料扩增目的基因,通过荧光信号检测DNA水平水平PCR Polymerase chain reaction 用特异性引物扩增目的基因,通过用特异性引物扩增目的基因,通过DNA凝胶电泳等方式检测凝胶电泳等方式检测DNA水平水平RT-PCR/RT-qPCRtranscrip...
(2)Promega RT-PCR试剂盒 (3)酚／氯仿：1：1混合 (4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2 (5)无水乙醇 2．仪器 基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。3．耗材 0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。【实验步骤】 1．...
三. RT-qPCR具体实验步骤 引物设计: 除了遵循一般的引物设计原则外,需要注意产物长度应控制在80-150bp。片段越短扩增效率越高,但若小于75bp则无法与潜在的引物二聚体区分,从而给判断引物优劣带来障碍。如果文献中有的话可以直接用文献中的引物,也可以自己设计。引物设计软件有:Oligo6, Paper ,Primer Premier 6等...
真核细胞RNA提取及RT-PCR 一、人骨髓细胞总RNA的提取(Trizol法提取) 目的: 1.掌握人骨髓细胞中总RNA提取的基本原理 2.熟悉Trizol法提取总RNA的原理和操作 原理: Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,再加入氯仿后形成两相,DNA与蛋白质存在于有机相,RNA保留于上层水相,将上层水样...
本实验先用Oligo引物反转录合成细胞cDNA模板,再用p53特异引物进行PCR扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53基因在两种肺癌细胞的表达水平。 二、实验步骤 1、细胞RNA的提取及鉴定 2、RT-PCR检测p53表达 三、实验结果 1、RNA浓度=0.8299ug/ul 2、A260=20.748 A280=10.436 A260/A280=2.01 3、pcr结果 四、实验讨论 ...
荧光定量PCR(Real-time PCR),是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团,通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。对照的目的是对检测的各个环节进行监控,因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量PCR的流程是:样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录(...
RNA提取的一般步骤 破碎组织 分离RNA 沉淀RNA 洗涤RNA 融解RNA 保存RNA 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行 •可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织•加入β-ME可以抑制RNA酶活性 2、分离RNA •一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层...
2. RT-PCR检测p53基因的表达可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带,H1299在390bp处没有出现扩增条带,可说明A549细胞中正常表达p53基因,经过RT-PCR扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带,H1299细胞则不表达p53,不出现扩增条带。由于我组实验结果为阴性,所以不能看出在实验步骤中混入RNase...