CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术,旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。 实验步骤: 1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质
病毒转染，是以病毒载体介导的一种高效的细胞转染技术，其将外源基因包装到病毒的外壳中，利用病毒的天然感染性，从而将外源基因导入宿主细胞当中，使外源基因在细胞中稳定表达。根据病毒载体不同，常见的分为腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆转录病毒（Retrovirus，RV）、腺相关病毒（AAV）。目前...
一、慢病毒转染 在我们的实验中,通常需要在细胞中导入质粒,以实现基因过表达(overexpression),敲除(CRISPR)或敲低(knockdown)。质粒导入的方法主要有两种:①瞬时转染:这种方法所需时间较短,但对于某些难以转染的肿瘤细胞,转染效率较低,并且只能在细胞内维持3-5天,最多约一周。②稳定转染:对于长期基因表达,实验室最...
我们常用的细胞转染方法有电穿孔法、显微注射、基因枪、脂质体转染,磷酸钙共沉淀法、原生质体转染、病毒介导的转染。 01 实验材料 无血清培养基、MEM-α或DMEM、polybrene、慢病毒 02 实验步骤 1. 贴壁细胞 (1)慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在...
一、慢病毒转染实验操作 1. 实验流程 慢病毒转染实验通常分为以下步骤：质粒构建：将外源目的基因插入质粒载体，构建重组质粒。病毒包装：将重组质粒与其他包装质粒共转染293T细胞，生产慢病毒。病毒收集与浓缩：收集含病毒的上清液，离心过滤后浓缩。感染靶细胞：将慢病毒加入靶细胞，进行感染。筛选与验证：通过药物筛选...
CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术,旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。 实验步骤: 1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。
在转染过程中，可以加入polybrene来提高病毒转染效率，但需要注意优化最佳浓度，通常在2–12 μg/ml范围内。转染前需确保细胞状态良好，收毒时间不宜过早，通常建议在转染后48小时以上再进行收毒。实验时，可设定培养皿中的细胞密度为4–5 x 10^6 cells/10 cm。若细胞分裂速度过快，可适当减少铺板细胞数量。建议...
慢病毒转染 慢病毒转染悬浮细胞实验方法 1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒,充分混匀。37℃孵育4小时。 2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基(无双抗培养基)以稀释polybrene。
我们尚恩生物公司对常用的细胞系,原代细胞进行慢病毒转染,包括细胞慢病毒转染绿色荧光蛋白(ZsGreen)或者红色荧光蛋白(mCherry、RFP)、细胞慢病毒转染化学发光LUC、细胞慢病毒SV40永生化转染,总共近40种稳转细胞系。也可以进行指定细胞的慢病毒转染。