如来自鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与来自鼠白血病毒莫勒尼株（Mo-MLV）均可用于合成第一链cDNA，AMV要求的反转录温度为42℃，而Mo-MLV则要求37℃，相对而言，Mo-MLV比较适合于RT-PCR，但由于其作用的最适温度为37℃，较AMV的42℃低，因此，对于具有较高二级结构的RNA模板可能会带来不利的影响。影响因素 （一）...
反转录PCR 1.反转录原理 反转录PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)又称为逆转录PCR。其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。 2.反转录试剂盒 3.PCR酶和PCR体系 试剂盒: 其他试剂盒...
反转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR),是指以mRNA为模板 在反转录酶作用下合成的cDNA 第一链的PCR。该反应分为两步,第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA 的互补链cDNA; 第二步加热后cDNA 与RNA 链解离,然后与另一引物退火,并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链DNA,最后同常规PCR一样,扩...
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。 在实际应用中,RT—PCR又常常分为一步法RT—PCR和两步法RT—PCR。 2实验流程 3特点 一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏,操作简便,污染率低,RNA二级结构减少,并且因为聚合酶有校正...
一步法RT-PCR中使用的基因特异性引物在较高温度下进行反转录。 3. RNase H 活性 反转录酶还具有降解DNA:RNA杂合双链中RNA的RNase H活性,降低此活性,可避免在合成较长cDNA之前模板RNA被降解掉。 野生型的M-MLV 具有RNase H活性,而通过突变去除RNase H 活性的反转录酶灵敏度更高,合成的cDNA更长。
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR) 答案 以mRNA为原始模板进行的PCR。先将mRNA逆转录生成cDNA,然后再进行PCR扩增。逆转录反应所用引物为寡聚胸腺嘧啶核苷酸,合成出cDNA第一链,再采用特异引物,以cDNA第一链为模板进行PCR扩增,最后扩增到大量的目的DNA片段。暂无解析相关推荐 1逆转录PCR(reverse transcriptio...
在利用RT-PCR扩增基因片段以构建表达载体时，为确保PCR过程的准确性，通常会选用保真性极佳的Taq DNA聚合酶，从而降低突变概率。目前，常用的反转录酶主要包括两类：一类源自莫罗尼小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，简称MMLV），另一类则来自禽成髓细胞瘤病毒（Avian myeloblastosis virus，简称AMV）。MMLV...
原位反转录PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术,与RT-PCR(液相)不同点在于,进行原位反转录PCR反应之前,组织标本要先用DNA酶处理,以破坏组织中的DNA酶,这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA,而不是细胞中原有的DNA。其它...
RT-PCR是从RNA模板合成cDNA,然后进行PCR扩增。而PCR是直接从DNA模板进行扩增。所以RT-PCR需要增加反转录步骤,而PCR直接扩增DNA模板。 五、RT-PCR优点和局限性 优点: 1.高灵敏度:可检测低浓度的RNA分子。 2.特异性:使用引物特异性扩增目标cDNA,排除非特异物质的干扰。 3.可量化:通过实时PCR等技术,可定量检测RNA...