需要首先从样本中提取总 RNA 或信使 RNA(mRNA)、再通过逆转录获取 cDNA 模板,最后进行实时荧光定量 PCR 实验。目前,RT-qPCR 根据其实验步骤的不同,可分为“一步法”与“两步法”。 RT-qPCR的一步法与两步法 一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完...
在 RT-PCR 过程中,RNA 分子首先转化为互补 DNA (cDNA),然后进行 PCR 扩增。在一步法 RT-PCR 中,反转录酶和 DNA 聚合酶预混于同一个反应管内,这样就能在单个反应中同时进行反转录和后续的 PCR 扩增。与两步法 RT-PCR 相比,一步法 RT-PCR 的优势包括分析简单快速、移液...
300µl RT-PCR MIX 20µl 实验操作:1． 取103-106拷贝的特异目的模板或1pg-1µg 的总RNA 或1-10ng 纯化的mRNA 于一支0.2或 0.5ml 离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。（此步骤是为了变性RNA ，建议保留） 2． 反应体系的配制： 组分 体积 终浓度 2× 反应缓冲液 ...
实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,即qRT-PCR或qPCR),是对基因和基因转录水平(即RNA)定量的重要方法。对于RNA的定量,需反转录(Reverse Transcription,即RT)和定量(qPCR)两个过程。 根据实验操作步骤的不同,可分为:一步法One-step RT-qPCR、两步法Two-step RT-qPCR。 One-step RT-qPCR 实验过程:RT与qPC...
RT-PCR中模板的选择 在RT-PCR 实验中,选择总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。mRNA虽然能提供略高的灵敏度,但总RNA经常使用,具有较mRNA更重要的优势。第一,其过程需要较少的纯化流程,这保证了更好的回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。第二,避...
2.One-Step RT- PCR加样体系 TU-15ul TU-24ul TU-38ul 1ul(现用现取,用完后立 TU-4 TU-5 TU-6 即放回) 1ul (现用现取,用完后立即放 回) 1ul( 现用现取,用完后立即放回) 3.反应程序: 4.电泳: TU-71ul TU-81ul TU-915ul 模板13ul 50℃45min 94℃预变性5min 94℃变性60s 55℃...
Step 3 按下表设置PCR反应条件: 反应温度 42°C 95°C 94°C 55-65°C 72°C 72°C 反应时间 30 min 3 min 30 sec 30 sec 30 sec 5 min 反应循环数 1 1 35-40 1 说明 逆转录步骤 预变性 PCR循环步骤 补充延伸步骤 Tips 为避免非特异扩增,一步法反应液的配制应始终在冰浴中进行,待PCR仪器...
一步法RT-PCR实验指南 一.一步法原理 One step RT-PCR采用了一步反应法完成整个RT-PCR反应,即RNA-cDNA-qPCR反应操作在同一反应体系中进行,反应过程中不需增加额外的步骤,就可完成整个RT-PCR反应,具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点,可适用于各种动物、植物、病毒RNA的qPCR检测。
常见的RT-qPCR流程一般分为RNA提取,逆转录、荧光定量PCR三个步骤,当有的课题需要对某物种进行多种处理后,检测某个基因的表达水平,以验证该基因应对不同胁迫压力的耐受力;或者经某种病原菌侵染后,检测寄主不同基因的表达水平,以探究可能涉及的通路及互作机理等……对于这几类样本数量较大,但样本只需要检测一次的实...
AllStart®/ATG® HSOne Step RT-qPCR SYBR Green Kit (ATG #R305 & ATG #R405) 基于 SYBR Green I 嵌合荧光法,针对以RNA为模板 (如RNA类病毒) 的荧光定量PCR快速检测设计,结合使用基因特异性引物,可使逆转录和qPCR反应在一管内完成,无需额外操作,降低污染的风险同时,也极大提升了检测通量,更适于定量...