质粒提取的方法主要根据质粒DNA分子量的大小，所用细菌的种属，细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。1、质粒DNA的分子大于15kb时，在质粒抽提过程中容易受损，可以采用比较温和的裂解方法，将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜，这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的...
质粒提取最常使用的是碱裂解法。即在强碱性条件下，使质粒 DNA 和基因组 DNA 同时从细胞中释放出来，并发生变性而便于纯化出来。市售的大多数试剂盒都是基于碱裂解法原理。碱法抽提适用于小量制备 15 kb 以下的质粒 DNA (大于 15 kb 的 DNA 在碱法提取过程中很容易断裂)。图 3. 质粒提取过程。 利用离子去...
当所提取的质粒大于10 kb时,由于菌体承载力有限,大质粒复制效率往往会低于普通质粒,因此推荐增大菌液量以获得更好的提取产量。 低拷贝质粒 当所选质粒为严紧型质粒时(如:pSC101和p15A)其提取产量往往偏低,为获得良好的提取效果应适当增大菌液提取量。 裂解不充分 当提取质粒时未能充分重悬菌体导致大的菌块残留,...
图1 大肠杆菌质粒分子结构示意图 质粒提取方法及原理 质粒的提取是分子克隆中常用的一种技术，即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒的过程。质粒的质量直接影响到基因操作的后续步骤，如转化、酶切和序列分析等，因此获得足够量的质粒是质粒应用的重要一步。生物学实验中...
质粒提取分类 大多数实验室都会选择基于碱裂解法的质粒提取试剂盒来提取质粒,根据不同的样本量及获取目标质粒的产量分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。 1、质粒小提 质粒小提主要是对于1-5mL的菌液中质粒DNA进行小量提取,获得的质粒用来进行常规的载体构建实验。 Absin金牌产品:无内毒素高纯度质粒小量快速提取试剂...
碱裂解法是一种有效的质粒提取方法,是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性,将质粒分离出来的方法。其操作流程如下: 1.将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl(pH 8.0)的盐水洗涤。 2.加入含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer(血浆蛋白)溶液,充分振荡混合,放在65℃水浴中加热,使细胞破裂并释放DNA和...
质粒提取分类 大多数实验室都会选择基于碱裂解法的质粒提取试剂盒来提取质粒,根据不同的样本量及获取目标质粒的产量分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。 1、质粒小提 质粒小提主要是对于1-5mL的菌液中质粒DNA进行小量提取,获得的质粒用来进行常规的载体构建实验。
质粒提取类型 质粒提取即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。通常从具体操作方法分为:碱裂解法、煮沸法、试剂盒法等;从提取产量上分为:小提、中提、大提。 01 碱裂解法 碱裂解法提取质粒用到三种溶液: ...
按照无内毒素质粒小提中量试剂盒（天根，DP118）进行质粒小量提取：1.柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。2.取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,...
质粒提取的操作，大家基本上都能够正确地完成，但是质粒提取背后的原理，未必每个人都清楚。除了常规的质粒抽提外，还有质粒大提，质粒快提等试剂盒。唯有搞清楚原理，才能更好地掌握质粒提取。细菌中存在蛋白，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我们的目的是把质粒DNA给拽出来，而且不能掺杂其他的生物大分子。蛋白...