1、从文献中直接查找,经过BLAST验证引物特异性后直接使用: (1)如何在文献中查找引物: ①打开pubMed或百度学术输入所查基因名称,翻看相关文献 ,选定文章内的引物(Forward/Reserve)打开NCBI; ②NCBI-BLAST验证:点击BLAST 图1 ③打开Prime-BLAST 图2 ④输入文献中查询到Forward/Reserve引物:设置参数,PCR产物长度80-200...
荧光定量PCR引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核...
引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大的差异，当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成，而当末位为T时，错配引发效率大大降低。因此引物3’端尽量避免选择A，以选择T代替。若为探针引物，则探针5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的...
荧光引物设计原则 1. 引物长度。 适宜范围的原因:18-24个碱基对的长度能在保证与模板特异性结合的同时,维持合适的退火温度和结合稳定性。碱基对过少,如小于18个,引物与模板的结合位点可能不足,容易出现错配,导致扩增的特异性降低,可能会扩增出非目标片段。碱基对过多,如超过24个,引物与模板的结合可能过于紧密,...
荧光引物在PCR扩增、实时荧光定量PCR和DNA测序等技术中都有重要应用。 二、荧光引物的种类 1. TaqMan探针:由一个特殊设计的寡核苷酸序列和两个荧光染料(FAM和TAMRA)组成,其中一个染料作为信号发射器,另一个染料则作为内部参照。 2. 分子探针:由两个分子组成,一个是靠近3'端的荧光基团(如FAM),另一个是靠近5'...
荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种技术手段。它通过在PCR体系中添加荧光基团来显示DNA产物的累积情况,从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。并且可以通过数据分析计算出起始模板量,这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。 荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里,所以在实验过程中,我们需要...
进入后界面呈现如图四,这里一定要核对一下你的基因是否正确(本人吃过亏,请务必慎重)。找到有primer pair 4绿色标志的一对引物(图五),这对引物是经过验证的,验证结果可点击绿色部分查看,结果如图六所示,这对引物可以直接拿去合成使用。(一般验证过的引物出现在最下面,注意不要遗漏)...
在常规PCR反应中，引物通常是合成与目标DNA序列互补的DNA片段，但在荧光引物PCR中，引物被荧光标记，以便在扩增过程中进行实时监测。荧光引物通常通过化学合成与常规DNA引物结合，荧光基团可以是荧光染料、量子点、荧光棒等。这些荧光标记物与引物结合后，可以大大提高PCR反应的特异性。此外，荧光引物还可以通过检测荧光...
荧光PCR引物设计要求主要包括以下几个方面: 引物长度:一般为15-30碱基之间,具体取决于所使用的聚合酶和上下游引物的相对位置。 引物特异性:引物应具有特异性,能够特异性的扩增目的基因,避免与基因组DNA或cDNA中的其他序列发生非特异性结合。 引物GC含量:引物的GC含量应适当,一般在40%-60%之间,以保持PCR反应的稳定...
📏 引物设计是实时荧光定量PCR的关键步骤!以下是一些重要原则:1️⃣ 引物长度:建议为20或21个碱基,确保特异性。2️⃣ 避免连续5个或以上相同碱基,以减少非特异性扩增。3️⃣ 引物两端最好包含G或C碱基,以增强与模板的结合稳定性。4️⃣ GC含量应在45%至55%之间,以优化PCR效率。5...