一、慢病毒基础简介慢病毒是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体; 属于逆转录病毒载体; 对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力; 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌…
依据实验需求，挑选适当的慢病毒载体，该载体应带有荧光标记和筛选标记，以便后续实验的监测和筛选。随后，采用常规的基因克隆技术，将目的基因精准地克隆至载体之中。3、慢病毒包装过程 （1）进行细胞转染：将构建好的慢病毒重组载体与辅助载体pSPAX2和pMD2.G共同转染至HEK-293T细胞中。这一步骤是慢病毒生产的关键...
第三代的慢病毒载体载体中会包含HIV-1基因组中的顺式调节元件(HIV-1ψ ),3’LTR作为增强子; cPPT(来自HIV-1整合酶基因),增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数,提高病毒滴度;载体设计时都需要加入启动子(promoter)序列,以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类,后者包括CMV启动子和PGK...
第三代四质粒系统，为了进一步减少重组成RCV的可能性，进一步根除慢病毒载体的生物安全风险，开发出了更安全的四质粒系统，这是目前被广泛使用的慢病毒载体系统。在三质粒系统的基础上，将gag-pol基因、rev基因（gag，pol 的转运需要 rev）分别构建在2个单独的质粒上，去除了tat基因，形成四质粒的系统。包装质粒，...
**也可直接从公司买来病毒液(-80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存3天):滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene(-20℃分装保存):溴化己二甲铵。是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率,通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性,需要摸索浓度(1～10μg/ml...
图1 稳转细胞株构建流程。 慢病毒及慢病毒载体 1)慢病毒载体的概念 慢病毒(Lentivirus,LV)属反转录病毒科(Retrovirus),是球形包膜病毒,直径约80-120nm,含两个拷贝的单链RNA基因组(图2)。基因组包含在由结构和酶促蛋白核衣壳(NC)、衣壳(CA)、逆转录酶(RT)、整合酶(IN)和蛋白酶(PR)组成的核心内,核心被基...
载体构建准确性：测序结果与预期序列 100% 匹配，酶切、PCR 鉴定条带大小精准，表明重组 hTERT 启动 CD 慢病毒载体成功构建，各元件连接无误，为后续功能研究提供坚实分子基础，从根源保障实验科学性，任何细微构建偏差都可能误导功能解读。肿瘤细胞特异性表达：荧光定量 PCR 与 Western blot 显示肿瘤细胞系中 CD 基因...
构建稳定株步骤如下（以Saos-2细胞为例）：1) 细胞铺板 将Saos-2细胞按30%汇合度接种到6孔板：① Saos-2细胞配成2.0×105cells/mL细胞悬液，待铺板。② 每孔铺2mL，即4×105cells/well，铺1个6孔板。2) 感染慢病毒 细胞铺板后12-20h感染病毒 ① 加病毒量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×...
目前用于转染的病毒载体包括γ逆转录病毒,慢病毒,腺病毒等,其中γ逆转录病毒和慢病毒属于逆转录病毒,能够将基因组RNA逆转录为DNA,并且整合到宿主基因组中,从而达到目的基因稳定表达的目的。慢病毒稳转细胞系的构建主要分为病毒包装和慢病毒感染细胞两个部分。