1、首先从样本入手:先应得定量样本,严格的rt是要求反应的rna量是一致的,这样通过判断内参的表达一致与否判断结果的可信性。最佳上样量1-2ugRNA,每管。 2、从反应条件讲,必须保证反应发生在pcr指数扩增区,可以配成一个50ul的反应体系,每跑5-10循环取出10ul跑电泳,直到达到产量饱和,找到最佳循环数。 3、选好内参。
半定量RT-PCR参照的做法一般有两种:1) 将要比较的两个样品的BETA-ACTIN 调成一样的亮度,然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观,但较费事。2) 不进行调平,一个样品里将目的基因和BETA-ACTIN直接比较,用软件就可以做到,然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简...
rt-PCR不知道基因的时空表达,但它能分析某个时空(时,发育阶段;空,取材组织或部位)的样本中mRNA的数量. mRNA被反转录成cDNA,实时监控每轮pcr后产物的量,达到分析不同mRNA的含量,mRNA的含量反映了基因的表达. 分析总结。 mrna被反转录成cdna实时监控每轮pcr后产物的量达到分析不同mrna的含量mrna的含量反映了基因的...
逆转录PCR或者称反转录PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作"逆转录",由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随...