在进行Western Blot检测时,明智的做法是一步一步地进行操作。要成功地进行Western Blot,每一步都不应该被忽视。包括:(1)WB缓冲液制备,(2)样品制备,(3)凝胶电泳,(4)蛋白转移,(5)封闭,(6)抗体培养,(7)WB检测与成像,(8)数据分析。 (图1 western blot大概的一个流程示意图) 1.1 凝胶电泳(Gel Electrophoresi...
接着是保证蛋白浓度，即要加入适量的裂解液，太少会使蛋白提取不充分，太多则蛋白浓度太低，一般经验是...
1、WB实验原理 免疫印迹(Immunoblotting)又称为蛋白质印迹(Western Blot,WB),是一种综合性的免疫学检测技术,用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。 这项技术利用待检测蛋白与抗体的特异性结合,测定生物样本中的蛋白水平,已经被广泛应用并得到公认。 目前,WB技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性...
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即 Western Blot,其工作原理是经过 PAGE(根据分子大小)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,然后将目的蛋白与特异性抗体进行孵化。由于抗体只与目的蛋白结合,未结合的抗体被洗掉,只留下与目的蛋白结合的抗体。最后通...
一、原理 蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
(图1 western blot大概的一个流程示意图) 1.1 凝胶电泳(Gel Electrophoresis) 在这一步中,我们将使用正极吸引带负电的蛋白质,根据分子量分离样品裂解液中的单个蛋白质。为此,我们将先前制备的蛋白质样品加入(load)聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶有固定百分比或梯度的丙烯酰胺。丙烯酰胺含量越高,凝胶基质的孔径越小。因此,高...
实验原理 蛋白质免疫印迹法，即Western Blot，基本原理涉及通过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）对蛋白质样品进行分离，随后将其转移至固相载体，如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜。固相载体以非共价键方式吸附蛋白质，同时能够保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性的不变性。在该过程中，固相载体上的蛋白质或多肽被作为抗原...
图 1. Western blot 的流程图[2]1.万丈高楼第一步：准备材料 要想实验节奏稳，准备工作那可要妥妥...
Western Blot实验原理 蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 实验步骤 1. 样本制备 1)融解RIPA裂解液(RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液),混匀。取适当量的裂解...
为了解释这些情况,我们还是需要回归到本质,了解western blot的曝光原理,才能高效获取实验结果。 Western blotHRP-鲁米诺-过氧化氢显影液体系 我们将蛋白转印到PVDF或NC膜后,需要思考如何将特定蛋白以肉眼的方式显现,并且能够进行定量比较。我们知道蛋白是不能直接被肉眼观察和显影的,需要借助一定的显影物质的力量...