一、ECL的发光原理: ECL(enhanced chemiluminescence)发光液是基于鲁米诺(Luminol)的新一代增强型化学发光底物试剂,即辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物液,是目前WB检测中最常用高灵敏的显色试剂。ECL试剂的核心原理为氧化反应发光:鲁米诺作为发光底物的主要成分,在碱性条件...
ECL的工作原理: 二抗经过酶或其它方式标记,经过底物显色可以特异性地检测样品中某个蛋白的表达量,目前偶联二抗最常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP),在碱性条件下,HRP可以催化鲁米诺和过氧化氢反应产生光子信号,进而被X射线胶片和化学成像仪捕获。目前市面上常...
Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，将为实验结论提供强有力的佐证。显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。显色方法主要有以下四种：放射自显影，增强化学发光法（ECL），酶促...
我们知道ECL,DAB,NBT/BCIP是比较常用的三种显色方法,其中ECL和DAB都是HRP的底物,NBT/BCIP的酶是碱性磷酸酶。而目三者的颜色显示不同,DAB的显色是棕褐色,NBT/BCIP显蓝色,ECL显荧光。在灵敏度方面,ECL化学发光的灵敏度最高,为1~5pg,也有达到fg级的,BCIP/NBT的灵敏度100pg,DAB的灵敏度最低,大约为500pg。在...
WB显影是Western Blot实验的最后一步,其原理是实验中的二抗被HRP(辣根过氧化物酶)标记,通过采用增强化学发光法(ECL)进行显色。ECL的化学发光液主要成分是鲁米诺(luminol)及异鲁米诺衍生物。鲁米诺和H2O2混合后作为底物,可在HRP的作用下发荧光,利用X光片或化学发光成像系统采集图像。 二、WB显...
原理: ECL检测WB膜上蛋白的示意图 WB从复杂的蛋白质混合物开始,通过凝胶电泳利用电荷和分子质量将其分离,并将分离的蛋白质印迹转移到膜上。然后将膜培养在含有已知能与目的蛋白结合的抗体(一抗)溶液中孵育,该过程中一抗与目的蛋白结合。此后将膜培养在含有已知能与一抗结合的抗体(二抗)溶液中孵育,该过程中二抗与...
原理：基于抗原-抗体特异性结合反应，但结合了电泳分离和膜转移技术。首先通过SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量分离，然后将蛋白质从凝胶转移至固相膜（如PVDF或硝酸纤维素膜）上，再加入一抗和酶标记的二抗体，通过化学发光或显色反应检测目标蛋白。检测方式：通过化学发光（ECL）或显色反应检测。2. 应用 ELISA：定量...
一、ECL的工作原理: 化学发光技术经过多年的发展,已经有多种发光体系,但实验室最常用的仍然是基于鲁米诺(Luminol)或者其衍生物(异鲁米诺等)的技术体系。鲁米诺试剂通常稳定存在且不会发射光信号,一旦和特定性的酶进行相互作用之后,能够转换成一种发光产物。
常见的WB显色的方法主要有：放射自显影、化学底物发光ECL显色、底物DAB显色、荧光显色（无需发光液）。因为ECL化学发光成灵敏度高且容易检测，是多数实验室的首选检测方法，检测原理是二抗偶联的是辣根过氧化物酶（HRP）或者碱性磷酸酶（AP），可以催化H2O2与鲁米诺反应发光，从而被胶片或者数字成像系统检测到。1)将...
WB显色拍照:关键步骤与注意事项 在Western Blot实验中,显色拍照是最后一步,也是对前面所有步骤的最终检验。我们的目标是获得高特异性、低背景的显色图像,为实验结论提供强有力的佐证。显色的原理相对简单,实验中的二抗被辣根过氧化物酶(HRP)标记,接下来采用增强化学发光法(ECL)。操作步骤 准备工作...