wb抗体用5%的脱脂奶粉(1‰TBST溶液)或者1%的BSA(1‰TBST溶液)配置,可以先让抗体与奶粉或BSA蛋白非特异结合,就不会与PVDF膜上的蛋白结合了。
4. 缓冲液:30% Acr/Bis(棕色瓶)、10% 过硫酸铵、1×转膜缓冲液、5%BSA或脱脂奶粉封闭液(4℃保存);1.5M Tris-HCl(pH8.8)、1M Tris-HCl(pH6.8)、10% SDS 、5× SDS凝胶还原型加样缓冲液、10× TBS、10×Tris-Gly电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、1× Tris-Gly电泳缓冲液、TBST(常温保存)。 5.缓冲液...
1.采用milk,BSA和gelatin的单方。3% milk,5% BSA,<=0.4%的gelatin,并根据实际情况改变(若出现白板,请降低封闭剂浓度。;黑板多加)。gelatin大家可能比较陌生,不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方,你会发现很多抗体溶液里都有它。 2.很多情况下单方...
BSA(5 mg/ml) 1ml -20ºC PBS稀释液 30ml 2-8℃ PC0030 Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 Folin酚甲试剂A 200ml 2-8℃ Lowry法测定较为不受脂类物质干扰,适于脂类含量较高的样品测定。也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。 Folin酚甲试剂B 5ml 2-8℃ Folin酚乙试剂 20ml 2-8℃ BSA(5 mg/ml) 1ml -20...
一抗(要让膜的正面与一抗完全接触,以便一抗和目的蛋白充分结合;一抗可重复利用, 用 BSA 或者 1×TBST 稀释,其中 BSA 稀释可保存较长时间)过夜孵育后,将 PVDF 膜在 TBST 中漂洗 5-10min/3 次,洗膜时在摇床下水平进行,使膜的各个部位洗的比较均匀,以除去未 结合的抗体。尽量将膜分开洗,因为膜之间会发生...
一抗稀释:4%BSA by Super Block,1:1000。亦加入0.02%的叠氮钠NaN3。 孵育:RT,约3h。 洗:TBST,3 x 5min 6、二抗孵育 所用抗体:HRP,anti-mouse。 二抗稀释:5%Nonfat milk by TBST,1:2000.(二抗一般用两次或三次就更新)(强调:二抗中不可以加NaN3,,因为其会抑制HRP的活性) ...
5 吸去血清,每孔滴加200微升一抗(1:200或1:100,稀释液为:1%BSA0.5%Triton),4摄氏度过夜6 吸去一抗,PBS洗三次,每次5分钟7 吸去PBS,每孔滴加2 52、3滴生物素标记的二抗(试剂C,山羊抗兔),室温下孵育10分钟8 PBS洗三次,每次5分钟9 吸去PBS,每孔滴加23滴链霉素过氧化物酶溶液(试剂D),室温下孵育...
用5% 牛奶的 1*TBST 稀释的二抗(BSA 稀释二抗会产生较高背景),室温 1 h 孵育即可。 11 掌控好曝光或压片时间 磷酸化蛋白检测除了容易有杂带外,还容易出现高背景。所以曝光或压片的时候注意掌控好时间,时间太长会使得背景深,过短又会不容易曝出条带或曝出条带很浅,所以需要优化出适合自己靶蛋白和实验体系的最...
五. 洗涤:TBST 洗5 mins 3-5 次。 六. 第二步反应:将膜跟5%牛奶或2%BSA稀释的2 抗一起孵育,室温1hr。 七. 洗涤:TBST 洗5 mins 3-5 次。 八. 显色: 4. western blot 所需buffer 的配方是什么? 答:主要的buffer有: 1) 2×Separation buffer (PH: 8.8) ...