,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,是检测蛋白的重要方法之一。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记...
加完电泳液后,按照红对红、黑对黑插入电极,打开电源,设置参数,起初,电压可低一点(如70V左右),待蛋白缓慢跑至浓缩胶与分离胶的交界处压缩成一狭窄的蛋白区带后,再转为高电压(为保证蛋白均被压缩,低电压时间可长一点,待所有蛋白条带均进入分离胶后,再转为高电压,低电压有利于浓缩胶对蛋白的压缩,对于分离胶内...
高浓度胶(如15%或更高):适合分离小分子量蛋白质(小于25 kDa)。 蛋白分子量Marker:将分子量标准物上样至第一泳道。 阳性对照和内参对照:加入阳性对照和内参对照以确保实验的准确性。 上样与电泳:将样本上样至相邻的孔中,所有样本均含有等量蛋白,然后进行电泳。 电压设置:一般设置在100-200V之间,具体取决于凝胶...
处理方法：使用BCA法、Folin酚法、Bradford法等方法进行样本蛋白浓度检测，保证样本提取成功。原因-2. 样本中不表达目标蛋白：对样本中蛋白表达情况并不是很熟悉，可能需要检测的目标蛋白在样本中根本就没有表达。处理方法：在参考文献或Uniprot/NCBI上查找对应蛋白的组织表达特异性，分析可能的表达量，判断自己样本中的...
接下来，我们详细了解一下WB的具体操作步骤：01 蛋白质的提取 对于组织蛋白的提取，首先将少量组织块置于匀浆器中并剪碎，随后加入含有PMSF的单去污剂裂解液进行匀浆。匀浆后置于冰上，并重复几次以确保蛋白充分释放。裂解30分钟后，将裂解液移至离心管中，在4℃下以12000 rpm的速度离心5分钟。取上清液分装并保存于...
上期与大家分享了蛋白免疫印迹的实验原理、流程以及实验过程好物推荐,本期小编将会在上期的基础上继续深挖蛋白免疫印迹实验中的常见问题及对应解决方案。 一、实验流程 在此之前,我们先回顾一下关于WB的实验流程,纵观整个流程图可以看出,一套WB实验,从蛋白样本处理到最后发光显影获得实验结果,流程是相当复杂繁琐的。并且...
Western Blot即蛋白免疫印迹，行话常常将其称为WB,是将细胞或组织总蛋白质通过电泳从凝胶转移到固相支持物NC膜（硝酸纤维素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的技术。该技术中被检测的特定抗原指目的蛋白。特异性抗体指一抗和二抗（二抗是指一抗的抗体，如一抗是从兔中获得的，...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。3. 膜封闭和抗体孵育 1) 转膜以后，用10ml的1×TBST室温洗膜5分钟，洗三次。2) 5ml奶粉封闭液（或3%BSA的TBS）室温孵育2 h或者4℃平缓摇动过夜。3) 10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟...