最近做了几次磷酸化蛋白的western,目的蛋白和内参(beta-actin)都没有曝出!极受打击... 我用ripa裂解液提的细胞蛋白,裂解液中加了酶抑制剂,蛋白浓度测定在4~12ug/ul,上样量调整到60ug/孔。样品是加了上样缓冲液煮沸后保存在-80度,分装,不超过两周,一次用一支。 电泳条件:浓缩胶60V,12%的分离胶100V。 转...
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一,不知为何呢?(且两边的2条带经常出不来) 注:同一个样品,一管中加入待测样品和LB,混匀、煮5min , 离心一会,取上清于新EP管中,混匀后上样。 转膜也是常规操作啊,60V,2h;洗膜后奶粉封闭1--2h,以抗过夜,洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。 用的是乐扣最...