1. 蛋白提取 蛋白提取是WB成功的先决条件~ 1.PBS清洗细胞或研磨组织 (液氮研磨或匀浆器) ; 2.加入适量的裂解液(已添加蛋白酶抑制剂) 裂解细胞 (通常比例为每106个细胞中加入100 μL裂解液; 3.低温持续振荡15-30 min; 4.冰上超声,20-30%功率,1-2 min,或者使用1 mL注射器进行抽打,断裂DNA; 5.低温最...
实验步骤: ①实验样品准备 裂解液直接裂解法: 1.将全部试剂及耗材放入冰盒箱中预冷。 2.将细胞培养瓶或者培养板中的培养液吸出,用已经预冷的PBS 清洗两遍,并用移液枪将PBS吸净,加入裂解液裂解细胞。 3.用细胞刮板将培养瓶或者培养板中的细胞轻轻刮下,驱赶到一个角落中,并将细胞悬液用移液枪转移到已经预...
3.去上清留沉淀，加入适量1X PBS,吹悬细胞，1000-1500 rpm,离心3-5 min，并去除上清留沉淀。4.按照10-20 μL细胞沉淀加入50-100 μl细胞裂解液（RIPA裂解液或者WB裂解液），加入1 μl pro(蛋白酶抑制剂）,1 μl PMSF，冰上放置（或者放置4℃冰箱）裂解，冰上裂解半个小时，期间震荡混匀两次，裂解至无...
参照抗体说明书的WB稀释比例，用抗体稀释液稀释好一抗，将膜从封闭液中夹出用滤纸吸去多余液体，放入抗体孵育盒中，倒入稀释好的一抗，过夜孵育。2.8二抗孵育 根据一抗来源选择合适的二抗，参照抗体说明书的WB稀释比例，用抗体稀释液稀释好二抗。将一抗孵育的PVDF膜用TBST洗涤3次，每次5min，将膜从洗涤液中夹出...
wb的简化步骤 WB即Western blot,是一种综合性的免疫学检测技术。其简化步骤如下: 1. 提取膜蛋白或者总蛋白(主要使用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂,低温操作)。 2. 制胶(玻璃要洗干净,缓慢铺胶)。 3. 跑电泳(电泳液可以使用干粉直接加双蒸水的,也可以使用SDS、甘氨酸和Tris配制。上层胶80V+30min,下层胶...
三、WB实验步骤 由于文章篇幅限制,小编这次先介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程。 蛋白提取 1 组织总蛋白提取 准备好所需要数量的样本管;放入研磨珠,置于冰盒上备用; 组织块先用预冷PBS洗涤 2-3 次,除去血污,然后放在滤纸上,吸尽多余的 PBS ...
WB实验的具体步骤及注意事项 一、实验准备1. 实验材料：抗体、蛋白样品、膜、孵育盒、洗涤液、标记二抗、显色液等。2. 实验设备：摇床、离心机、移液器、电泳仪、转印仪等。二、实验步骤1. 蛋白样品制备：根据实验要求，将细胞或组织破碎，制备成蛋白样品。在制备过程中，要保证样品的均一性和稳定性，同时避免...
完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。 2)贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL...
本文将详细介绍WB实验的步骤,以帮助读者了解该技术的操作流程。 1.细胞培养和蛋白提取。 首先,需要培养细胞并收集细胞样本。将细胞样本离心,去除培养基,然后用PBS洗涤细胞。接下来,加入细胞裂解液并振荡离心,收集上清液,即为蛋白提取物。 2.蛋白质浓度测定。 使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度,以确保后续实验...
基本步骤: 三大流程 Separation - - - - > Transfer - - - -> Detection 1.Separation(分离:加缓冲液并加热至95℃): 分离用到的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。