TBST)清洗三次,每次5分钟(清洗干净即可);清洗完成后,蛋白面朝下,放入配好的封闭液中,常用的封闭液有5%的脱脂奶粉以及其他新型快速封闭液等,前者往往需室温封闭数小时(约1～2h),而后者数十分钟即可,封闭完成后回收封闭液,按转膜完成后的清洗方法再次洗干净,放入配置好的...
一、蛋白准备（样品制备）（一）总蛋白提取(弱的RIPA裂解液或WB裂解液）1.方法一（胰酶消化）：去除细胞上清培养基，PBS清洗1-2次，加入适量胰酶消化，放置37℃，5%CO2培养箱中（不同细胞消化时间不同），消化完全，2倍于胰酶体积的完全培养基终止反应，吹散混匀，吸入至15 mL 离心管，1000-1500 rpm，离心3-...
暗室压片的优势在于灵敏度很高,因为X 胶片跟膜是贴合的,没有任何光信号的损失,并且图像真实,这两者也是部分实验室仍然保留暗室压片方法的主要原因。但是由于胶片中感光晶体对光信号的承载量有限,所以暗室压片的定量范围比较窄,强信号比较容易过曝,无法准确定量,此外由于X胶片对光很敏感,所以整个曝光显影过程要在单独的...
甲醇的另一个作用是降温,旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发,电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快,因此可考虑增加额外的甲醇;这点对半干转缓冲液的意义较大,因为半干转缓冲液消耗很慢,缓冲液放置的时间较久,甲醇挥发比较严重,可临时少量补加。转膜缓冲液的配制方法如下:39mM glycine(2.9g),48mM tri...
在电泳系统中,蛋白条带染色是一个重要的步骤,因为它直接关系到试验结果能否使用。目前,常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色法、银染法、负染法和荧光染色法。 考马斯亮蓝染色法 1、原理: 1963 年 Fazekas 等首次将考马斯亮蓝 R-250 应用到醋酸纤维素膜上的蛋白质染...
WB蛋白测定方法得流程分为几个关键步骤。首先是样本的提取以及处理。蛋白质提取液的选择至关重要,它直接影响到实验结果的可靠性以及重复性。常见的蛋白提取方法包括RIPA缓冲液、NP40等,这些缓冲液含有各种表面活性剂,可以有效地裂解细胞;释放出细胞内的蛋白质。在这个过程中;特别需要注意的是对样本的保护,避免蛋白质在...
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）实验方法 WB是一种半定量和定性分析目的蛋白样品的生物实验手段。本实验方法以分析变性蛋白样品为例简单叙述了一下WB的一些操作过程及原理。Day 1 细胞铺板：细胞铺6孔板（推荐铺板密度：50%的细胞密度），无抗完全培养基。Day 2 转染：推荐一个孔的转染体系 转染前将六孔板中旧的...
(2)蛋白提取:蛋白提取是WB实验的开端,裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本蛋白是否提取成功。蛋白提取整个过程都需严格在冰上操作,以减少高温造成的蛋白降解;若是磷酸化蛋白检测,提取液中需加磷酸酶抑制剂混合物。 下表是一些常见的不同类型样品的处理方法: ...
Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，将为实验结论提供强有力的佐证。显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。显色方法主要有以下四种：放射自显影，增强化学发光法（ECL），酶促...