转录激活(CRISPRa):通过使用dCas9融合蛋白来招募转录激活因子,从而达到靶标基因转录激活或上调的效果。在哺乳动物细胞中,VP64(一种转录激活子,由四个串联拷贝的单纯疱疹病毒VP16激活结构域组成,通过Gly-Ser连接子连接。)、p65激活结构域 (NF-κB转录因子核形式多肽的主要反式激活结构,p65AD) 或Rta47(人类疱疹病毒R...
1、CRISPRko敲除文库 通过sgRNA特异性识别靶序列，引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游3 位核苷酸外侧进行切割，造成靶位点DNA双链断裂，由非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制引入移码突变实现敲除。2、CRISPRa激活文库 通过连接dCas9蛋白与转录激活因子VP64实现Cas9蛋白与激活辅助蛋白共表达，完成全基因水平的上调表达。3...
VP64:来源于VP16, 是它的四聚体,所以16x4=64,就叫VP64了。 VP是virus protein的缩写,VP16来源于herpes simplex virus (HSV), 是transcription factor, 用于在被感染的细胞内促进一些基因的表达。 它主要有两个domain,一个用来帮助结合DNA,一个用于招募PoI II 等负责DNA转录的因子促进转录,叫Transcription activa...
通过连接dCas9蛋白与转录激活因子VP64实现Cas9蛋白与激活辅助蛋白共表达,完成全基因水平的上调表达。 3、CRISPRi干扰文库 通过将dCas9蛋白与转录抑制因子KRAB(Kruppel 相关框域)组成融合蛋白,与靶向基因上游调控区域的sgRNA共转染细胞从而干扰基因表达。 sgRNA文库构建主要是通过靶向同一基因设计并合成多条sgRNA,用CRISPR系...
肝细胞通过CRISPR/dCas9系统递送肝细胞有望治疗肝纤维化。Luo等人报道将包封在AML12细胞来源外泌体中的CRISPR / dCas9-VP64系统可以有效地递送到HSC中靶向抗肝细胞核因子4a(HNF4a),成为肝纤维化的基因治疗策略(图13)[9]。 图13. CRISPR / dCas9-VP64系统靶向HNF4a ...
VP64蛋白可结合RNA聚合酶,激活基因的转录,但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段,而sgRNA具有识别作用,可根据基因X的序列设计sgRNA,使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列,让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体。 [小问4详解] 利用CRISPR/Cas9及其改造产品可实现定点诱变、抑制有害基因或致病基因的表达等反馈...
这表明,CRISPRa的激活效果与sgRNA靠近TSS的程度呈正相关,可能是因为dCas9-VP64能够招募更多的转录因子和辅助因子,促进RNA聚合酶的结合和转录的启动。对于CRISPRi,当sgRNA结合在TSS下游100bp以内时,目标基因的转录水平显著降低,达到最小值。当sgRNA结合在TSS下游100bp到200bp之间时,转录水平仍有一定的降低,但高于最小...
方法合成为,合成sgRNA序列的核酸片段并插入到MS2P65HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化,选择单克隆菌株,提取MS2P65HSF1sgRNADLK1DIO3重组质粒,将重组质粒转染到已预先转染dCAS9VP64质粒的目的细胞株,得到上调DLK1DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株.本发明能快速,简便,准确上调细胞株中DLK1DIO3印记域上非编码RNA的表达...
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