采用Nanodrop测定cDNA浓度,并取相同体积cDNA分别进行qPCR实验,结果证明: 不同品牌逆转录产品的cDNA浓度相差较大,但定量实验Ct值几乎一致。 逆转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异,但最终Ct值几乎一致。 图1.qPCR检测结果△Ct<1,且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系 因此,cDNA浓度的...
(1)逆转录产物cDNA不可测浓度,因为逆转录产物中除了cDNA产物以外,还含有逆转录残留的Buffer、逆转录酶、引物等,会干扰浓度测定结果,同时引起OD260/280、OD260/230比值异常,因此不能反应真实的cDNA产量。这个时候会有小伙伴说,那我纯化后再测浓度;这里小V要提醒一下,cDNA不建议纯化,因为逆转得到的cDNA长短不一,纯...
① 模板稀释 将反转录的 cDNA 如图所示进行 10 倍梯度稀释,6 个梯度,依次设置为 S1-S6。 图2. cDNA 稀释流程 ② 根据 qPCR 试剂配制 qPCR 体系。 ③ 样品设置 qPCR 反应体系配制完成后,可参照下表进行样品设置,每个样品均设置 3 个技术性重复。 ④ qPC...
主要是用于验证RNA中的DNA有没有除尽!反转录第一条cDNA的合成:RNA-freeWaterUpto12.5uLTotalRNA(DNaseltreated)10ng-5ugReversePrimer终浓度100Pmol(可适量增大)轻轻混匀,65c孵育5min,之后放置在冰上5min;依照下列顺序加入下列物质:5*RTbuffer4RNaseinhibitor0.5dNTPmix(10uM)2ReverseTranscriptase1轻轻混匀,并且...
使用高纯度(不含 DNA 和蛋白质及抑制物)和高度完整(无降解)的 RNA进行实验是整个 RT-qPCR 实验流程中很关键的环节。降解或污染的 RNA 会产生低质量的 cDNA,从而导致 qPCR 反应效率低下,并导致不准确的低质量数据,具体表现为: ● RNA 不纯将导致对下游 PCR 反应的抑制,Cq 将右移,产生数据偏差。
2.或纯化好的总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间,完整性好)或总DNA(OD260/OD280在1.7-1.9之间,完整性好); 3.或反转录好的cDNA不少于30μl(反转录的总RNA完整性好,纯度在1.9-2.1之间); 4 .同时提供待测基因序列或登录号。 二、服务结果: 总RNA(或DNA)浓度,电泳图片,扩增曲线,熔解曲线,Ct值以及数据统计...
一. RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以 cDNA 为模板进行 PCR,在 P
对于RNA样本,试剂盒采用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA,同时采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。在优化的缓冲体系下,该试剂盒的检测灵敏度针对高表达的靶标, 可以检至0.1 pg,中等表达的靶标,可以检至1 pg。该试...
该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板,反转录为cDNA,使用基因特异性引物进行qPCR扩增,检测探针的荧光值进行定量。cDNA合成和qPCR反应在一个管中进行,反转录结束后可直接进行qPCR扩增而不用增加额外的步骤,有助于大量样品的处理并减少污染机会。并且可以加入多对引物,在一个管中针对多个基因进行多重...